分子生物学讲座2课件

第五节 RNA的结构与功能,引言 DNA是遗传信息的载体，遗传信息的作用通常由蛋白质的功能来实现，但DNA并非蛋白质合成的直接模板，合成蛋白质的模板是RNA。这就是著名的“中心法则”。,别名：吸盘鱼、琵琶鱼、清道夫 学名：Hypostomus multiradiatus 科种：鳅科和鲶科 产地：巴西、委内瑞拉 水温：2228,在水族中，有一种鱼人们称之为“清道夫”，他们专门清除其它鱼的皮肤上的外寄生虫，从而获得食物来源，而接受清除服务的鱼无论多么凶恶对它们会敬若上宾。清道夫鱼营小群体生活，头领是一条年长的雄鱼，另有三到六条雌鱼，其它的则是一些未成熟的小雌鱼，这就是说一群这类鱼中只有一条雄鱼。它们过着一种有严格等级的社会生活，所有雌性的鱼按从小到大地位越来越高，最高地位的那条雌鱼就是鱼群中的“后”。人们当然会担心那条“王”鱼死后这群鱼所面临的生存问题，其实当“王”死后，“后”便立即产生性转换，一跃变为雄鱼并成为了这群鱼中的“王”。研究表明，在这种性转换中，染色体没有变化。这一点是与中心法则完全相悖的。,与DNA相比，RNA有其特点： 种类多，分子量相对较小 一般以单股链存在，但可以有局部二级结构（发夹结构），其碱基组成特点是含有尿嘧啶(U)而不含胸腺嘧啶，碱基配对发生于C和G与U和A之间 RNA碱基组成之间无一定的比例关系，且稀有碱基较多 tRNA还具有明确的三级结构,(一)RNA的种类 信使RNA（message RNA, mRNA） 转移RNA(transfer RNA, tRNA) 核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA) 不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA) 小胞浆RNA(small cytosol RNA, scRNA) 端粒RNA(telomere RNA) 小核RNA(small nuclear RNA, snRNA),（二）不均一核RNA和信使RNA,遗传信息从DNA分子抄录到RNA分子中的过程称为转录(transcription) 。 人们发现，在真核生物中，在形成成熟的RNA之前，还有一个“前体”，就是不均一核RNA（primary RNA transcript ）。,hnRNA是mRNA的未成熟前体 hnRNA链中的一些片段将不出现于相应的mRNA中，这些片段称为内含子(intron)，而那些保留于mRNA中的片段称为外显子(exon)。也就是说，hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接(splicing)，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起 mRNA的5末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA 3末端多了一个100-250bp的多聚腺苷酸(polyA)尾巴,两者之间的主要差别,mRAN形成过程,mRAN形成过程,mRAN形成过程,(三)转运RNA(tRNA),tRNA分子有100多种，各可携带一种氨基酸，将其转运到核糖体上，供蛋白质合成使用。tRNA是细胞内分子量最小的一类核酸，由70120核苷酸构成。 结构上的特点包括：含有10%20%的稀有碱基，如甲基化的嘌呤mG、mA，双氢尿嘧啶(DHU)、次黄嘌呤等；含有稀有核苷，如胸腺嘧啶核糖核苷，假尿嘧啶核苷(，pseudouridine)等 。,tRNA中含有的稀有碱基和稀有核苷,tRNA分子内的核苷酸通过碱基互补配对形成多处局部双螺旋结构，它们和未成双螺旋的区的松散区域共同构成不同的环。 现发现的所有tRNA均可呈现所谓的三叶草型(clover-leaf pattern)二级结构。在此结构中，从5末端起的第一个环是DHU环，以含二氢尿嘧啶为特征；第二个环为反密码子环，其环中部的三个碱基可以与mRNA中的三联体密码子形成碱基互补配对，构成反密码子(anticodon)，在蛋白质合成中起解读密码子，把正确的氨基酸引入合成位点的作用。,tRNA的二级结构,第三个环为TC环，以含胸腺核苷和假尿苷为特征；在反密码子环与TC环之间，往往存在一个襻，由数个乃至二十余个核苷酸组成，所有tRNA3末端均有相同的CCA-OH结构，tRNA所转运的氨基酸就连接在此末端上。,tRNA的二级结构,tRNA的二级结构,tRNA的三级结构,通过X射线衍射等结构分析方法，发现tRNA的共同三级结构均呈倒L形，其中3末端含CCA-OH的氨基酸臂位于一端，反密码子环位于另一端，DHU环和TC环虽在二级结构上各处一方，但在三级结构上却相互邻近。 tRNA三级结构的维系主要是依赖核苷酸之间形成的各种氢键。各种tRNA分子的核苷酸序列和长度相差较大，但其三级结构均相似，提示这种空间结构与tRNA的功能有密切关系。,tRNA的三级结构（L型）,核糖体RNA(ribosomal RNA)，亦称核蛋白体,由rRNA和蛋白质组成。单个核糖体有二个亚基,分别称大亚基和小亚基。rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上，是蛋白质合成场所-核糖体(ribosome)的组成成分。 核糖体蛋白(ribosmal protein, rp)有数十种，大多是分子量不大的多肽类，分布在核糖体大亚基的蛋白称为rpl，在小亚基的称rps。,(四)核糖体RNA (rRNA),核糖体的结构,核糖体的结构,核糖体是rRNA与核糖体蛋白结合起来的小颗粒，是合成蛋白质的工厂，直径为14-30nm。在细菌的细胞内，核糖体散见于细胞质中。在高等植物细胞质中，大多数核糖体附着于内质网上。在细胞内含有大量的核糖体，在大肠杆菌细胞内约含有200000个核糖体，约占整个细胞干物重的25%。 核糖体两个亚基由镁离子Mg+结合起来。虽然不同生物核糖体的大小不同，但具有大致相同的三维结构，一般呈不倒翁形。,核糖体rRNA与mRNA一样也是DNA转录的产物。在真核生物中rRNA的合成在细胞核的核仁区域进行。rRNA基因转录首先形成rRNA前体。然后通过加工形成成熟rRNA。在大肠杆菌中转录时先产生30S的rRNA前体，再切割为5S、16S和23S三种rRNA及一种4S的tRNA。而在哺乳动物中，5.8S、18S和28S三种rRNA前体分割而成，而5S rRNA则由另外的基因转录而成。核糖体RNA在转录后，除加工成为成熟的rRNA外，其碱基还发生甲基化。甲基化可能与核糖体的稳定性有关。,在蛋白质合成过程中，核糖体是以70S（80S）存在，因为只有这种状态才能维持他们生理上的活性。一般说来，rRNA在细胞内远较mRNA稳定，可以反复用来进行多肽的合成，而且核糖体本身的特异性小，这就是说，同一核糖体根据与其结合的mRNA不同，可以合成不同种类的多肽。,(五) 其他的RNA,1、小核RNA(snRNA,small nuclear RNA) 存在于真核细胞的细胞核内，是一类称为小核核蛋白体复合体(snRNP)的组成成分，均为小分子核糖核酸。其功能是在hnRNA成熟转变为mRNA的过程中，参与RNA的剪接，并且在将mRNA从细胞核运到细胞质的过程中起着十分重要的作用,2、小胞浆RNA(scRNA,small cytosol RNA) 长约300个核苷酸，主要存在于细胞质中，是蛋白质定位合成于粗面内质网上所需的信号识别体(signal recognization particle)的组成成分。,第二章 DNA的生物合成,本章的内容主要涉及DNA生物合成的三个方面，第一，DNA复制，第二，RNA反转录为DNA，第三，细胞内DNA受到损伤时进行的修复作用。,第一节 DNA的复制,DNA做为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确地自我复制(self-replication)，使DNA的量成倍增加，这是细胞分裂的物质基础。 DNA分子复制是指以亲代DNA分子为模板合成子代DNA的过程。 曾经有过多种关于DNA复制方式的学说，包括半保留复制，全保留复制以及分散复制等。,一、复制方式 全保留复制(conservative replication) 在复制过程中新的DNA分子单链结合在一起，形成一条新的DNA双链，而亲本DNA双链仍然被保留在一起。 半保留复制(semi-conservative replication) 分别以两条亲本链为模板，合成二个新链，新形成的双链中，一条是原来的亲本链，一个是合成的新链。 分散复制(dispersive replication) 在复制过程中亲本双链被切割成小片段，分散在新合成的两条双链分子中,半保留复制,全保留复制,分散复制,1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。 他们将大肠杆菌放在含有15N标记的NH4Cl培养基中繁殖了15代，使所有的大肠杆菌DNA被15N所标记，可以得到15N-DNA。然后将细菌转移到含有14N标记的NH4Cl培养基中进行培养，在培养不同代数时，收集细菌，裂介细胞，用氯化铯密度梯度离心法观察DNA所处的位置。由于15N的DNA的密度比普通DNA(14NDNA)的密度大，在氯化铯密度梯度离心时，两种密度不同的DNA分布在不同的区带。,实验结果表明：在全部由15N标记的培养基中得到的15N-DNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。当转入14N标记的培养基中繁殖后第一代，得到了一条中密度带，这是15N-DNA和14N-DNA的杂交分子。第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N14N-DNA和14N14N-DNA。随着以后在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱，在紫外光下可以看到DNA分子形成的区带。,为了证实第一代杂交分子确实是一半15N-DNA半14NDNA，将这种杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心，结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15NDNA)及低密度带(14NDNA)。它们的实验只有用半保留复制的理论才能得到圆满的解释。 病毒和一些质粒的单链基因组是全保留复制的。,半保留复制方式的实验证明,几种DNA复制方式的解释,二、DNA复制的一般过程,DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成，复制开始时，双链打开，形成一个复制叉(replication fork,从打开的起点向一个方向形成)或一个复制泡(replication bubble,从打开的起点向两个方向形成。)两条单链分别做模板。各自合成一条新的DNA链。,名词说明： 先导链-leading strand 随从（滞后、后滞）链-lagging strand 冈崎片段- Okazaki fragment,DNA复制过程可以人为地分成三个阶段 第一个阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成， 第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。 第三阶段为DNA复制的终止阶段。 在DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加。,（一）DNA复制的起始阶段,1、DNA复制的起始点 很多实验都证明，复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫做复制起始点(origin of replication)常用ori或o表示。细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去，直至完成细胞中全部基因组DNA的复制。DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。在原核细胞中，每个DNA分子只有一个复制起始点，因而只有一个复制子，而在真核生物中，DNA的复制是从许多起始点同时开始的，所以每个DNA分子上有许多个复制子。,2、DNA复制的方向 定点开始双向复制：这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式，从一个特定位点解链，沿着两个相反的方向各生长出两条链，形成一个复制泡，用电子显微镜可以观察到复制泡的存在。 定点开始单向复制：质粒colE1是个典型的例子，复制从一个起始点开始，以同一方向生长出两条链，形成一个复制叉。 两点开始单向复制：腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单一方向复制出一条新链。,（1）解链酶(helicase) DNA开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。 解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。,3、DNA复制起始引发体的形成 及所参与的酶和蛋白质,（2）单链结合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP，SSB) 它与解开的单链DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解，保证了单链DNA做为模板时的伸展状态，SSBP可以重复利用,（3）引发体的形成： DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由DnaB. DnaC和单链结合蛋白组成。,1)引物酶(primase) 它是一种特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3-OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。,2)引发体(primosome) 高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3-OH末端接下去合成DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。,（二）DNA复制延长阶段,DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将游离的四种脱氧单核苷酸(dNTP)聚合成DNA的过程。 这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与。,1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶(DNA polymerase ,简写DNA pol)。后来又相继发现了DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNA pol起作用，而DNA pol和DNA polII在DNA错配的校正和修复中起作用。,1、聚合酶,需要DNA模板，因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, DDDP)。 需要RNA或DNA做为引物(primer)，即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。 催化dNTP加到引物的3-OH末端，因而DNA合成的方向是53。 三种DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。,共同性质,DNA复制从起始点开始向一个方向复制时，局部的DNA双链必须打开，主要靠解链酶的作用，打开后的单链还需要单链结合蛋白与其结合，在复制叉向前移动时造成其前方DNA分子所产生的正超螺旋，必须由拓扑异构酶来解决。,2、拓扑异构酶(topoisomerase),拓扑异构酶(topoisomerase)是一类改变DNA拓扑性质的酶。在体外可催化DNA的各种拓扑异构