生物化学酶促反应的速率和影响因素课件

4.3 酶促反应的速率和影响因素 (重点内容),米氏方程 pH和温度的影响,1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程,V-总反应速率，vmax-最大反应速率 S-底物的浓度 Km-米氏常数，Km=(k2+k3)/k1,米氏方程,K1,k2,k3-反应速率常数,酶,底物,酶-底物结合物,酶促反应速率与底物浓度的关系,底物浓度低时，反应速率与底物浓度成正比，表现为一级反应特征 当底物浓度逐渐增加时，反应速率不再按正比关系升高，反应表现为混合级反应 当底物浓度达到一定值时，几乎所有酶都与底物结合后，反应速率达到最大值，此时再增加底物浓度，反应速率不再增加,米氏常数Km,当反应速率等于最大速率一半时，即v=1/2vmax米氏方程可以表示为Km=S，Km的物理意义是当酶促反应初速度达到最大反应速率一半时的底物浓度，单位为浓度单位.,Km=(k2+k3)/k1,1. 不同的酶具有不同的Km值，它是酶的一个重要的物理常数。只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。 可以用来鉴别酶。,米氏常数Km是酶学研究中的重要数据,2. Km值表示酶与底物之间的亲和程度。 Km大，说明反应速率达到最大反应速率一半时所需的底物浓度高，表示酶同底物亲和程度小，酶的催化活性低； Km小表示亲和程度大，酶的催化活性高。,米氏常数Km的求法双倒数作图法,将米氏方程改写成,=0,= -,1/S= - 1/Km,影响酶促反应速率的其他因素,1. pH的影响 在一定的pH下，酶具有最大的催化活性，称此pH值为最适pH,pH影响反应速度的原因,( 1 )在不同的pH条件下，酶的活性中心与底物之间形成氢键的能力和方向不同。影响了酶-底物过渡态的形成和稳定程度，从而影响反应速率。,( 2 ) 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。,酶活力,即酶活性，指酶催化某一化学反应的能力 酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示.,单位时间内底物的减少量或产物的增加量,2. 温度的影响,1. 温度升高，酶促反应速率加快。通常温度升高10C,反应速度增加1-2倍。 2. 温度升高，酶的高级结构发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失,多数酶有一个最适温度，在最适温度下，反应速率最大 从动物组织中提取的酶，最适温度一般为3540C,思考题,一、选择题 1.米氏常数Km是一个用来度量( ) A、酶和底物亲和力大小的常数 B、酶促反应速度大小的常数 C、酶被底物饱和程度的常数 D、酶的稳定性的常数 2.某酶今有4种底物(S)，其Km值如下，该酶的最适底物为（ ） A、S1：Km510-5M B、S2：Km110-5M C、S3：Km1010-5M D、S4：Km0.110-5M,思考题,二、问答题 1. 简述如何测定一个酶的Km值。 2. 在一个酶促反应中，当底物浓度S为米氏常数Km的0.25倍时，反应速度V与最大速度Vmax的倍数是什么关系？,4.4 酶的结构和酶的催化作用机制,酶分子的结构特点-酶的活性中心 酶活性中心的测定方法 酶与底物分子相互作用 酶的催化作用机制,酶的结构与功能的关系,酶为什么具有催化功能? 它的极大的催化效率和高度的专一性与酶分子结构有何关系?,酶的活性中心,酶的催化能力只局限在酶分子的一定区域，只有少数特异的氨基酸残基参与了底物结合与催化作用，这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活性直接相关的区域称为酶的活性部位或活性中心。 酶活性部位在酶分子的总体积中只占相当小的部分，酶活性位点的表面积不超过总表面积的5%。,4.4.1 酶分子的结构特点,3.调控部位：不是酶的活性中心，调控部位的作用是调节酶促反应的速率或方向。可以与底物以外的分子发生某种程度的结合，引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用。,按照酶活性部位的功能，分为,1.结合部位：是活性中心，决定酶的专一性 结合部位在空间形状和氨基酸残基组成上有利于与底物形成复合物使参加化学变化的反应基团相互接近并定向。,2.催化部位：是活性中心，决定酶的催化能力 酶的催化部位与结合部位重叠或者靠近。催化部位含有多种具有活性侧链的氨基酸残基，如Ser,His,Asp,Cys等，及辅酶和金属离子。作用是使底物的价键发生形变或极化，降低过渡态活化能。,一个酶的活性中心不是一个点、一条线或一个面，而是一个空间部位。,酶活性中心的氨基酸残基在一级结构上可以相距较远，但通过肽键的盘绕折叠，在空间结构中都处于邻近位置。,酶活性中心的必需基团,酶活性中心含有多种不同的基团，其中一些基团是酶的催化活性必需的，称为必需基团。 在酶的催化过程中，这些必需基团与底物分子通过非共价力等方式，起催化作用。,酶活性中心的必需基团主要包括,亲核性基团 丝氨酸(Ser)的羟基，半胱氨酸(Cys)的巯基，组氨酸(His)的咪唑基 酸碱性基团 酸性门冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)的羧基 碱性赖氨酸(Lys)的氨基，组氨酸(His)的咪唑基 弱酸性半胱氨酸(Cys)的巯基，酪氨酸(Tyr)的酚羟基,酶活性中心的测定方法,切除法 化学修饰法 X射线晶体衍射法 基因定点突变技术,酶活性中心的测定方法-切除法,应用专一性蛋白水解酶将酶分子的肽键切除一部分，然后测定剩余部分的活性，如果仍有活性，表示被切除的部分中，不包括活性中心。多次排除试验，推断活性中心的可能位置。,酶活性中心的测定方法- 化学修饰法,酶活性中心氨基酸残基所含的官能团（巯基、氨基、羧基、羟基、咪唑基、胍基等） ，被化学修饰后，酶的催化活性降低甚至消失，选择一些试剂，对这些官能团化学修饰，测定修饰后酶的活性，可推断位于活性中心的氨基酸残基。,酶活性中心的测定方法- X射线晶体衍射法,X射线晶体衍射法是测定酶活性中心最有效的方法。 直接测定酶分子的三维结构，根据酶分子的三维结构及其他有关数据，可以确定酶活性中心位置、氨基酸种类和空间结构。 需要应用纯酶结晶样品和先进的X射线衍射仪，测试条件要求高。,酶活性中心的测定方法- 基因定点突变技术,应用基因定点突变技术，合成出在特定位点上氨基酸残基不同的酶。通过比较突变酶的活性，推断出活性中心的位置。,酶与底物分子相互作用,酶与底物分子之间的作用力,静电引力：如赖氨酸的-NH3+，门冬氨酸的-COO-，能与底物中带相反电荷的基团相互作用。 氢键：N,O 疏水键：,酶催化反应中，第一步是酶与底物形成酶-底物中间复合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。其中E-S复合物的形成是决定反应速率的关键步骤。,酶与底物的作用力主要有,2.酶与底物分子相互作用的形式及其意义,邻基效应和定向效应 与反应过渡态结合作用 多功能催化作用 手性选择结合作用,邻基效应： 反应的基团需要互相靠近，才能反应。,定向效应: 指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确方向。,底物分子结合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效浓度大大增加，有利于提高反应速率；另一方面，由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高效率和专一性的特点。,与反应过渡态结合作用,反应速率与形成的过渡态稳定性密切相关。 过渡态的形成与底物分子内的价键张力有关，最容易形成五元环或六元环过渡态的反应，速率比较快。,多功能催化作用,酶的活性中心部位，含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用。,手性选择结合作用,酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应按照单一方向进行。,4.4.4 酶的催化作用机制,酶促反应,化学反应方向主要取决于反应自由能变化Go 反应速率快慢，主要取决于反应活化能Ea,酶催化作用的本质,酶催化作用的本质是酶的活性中心与底物分子通过氢键、离子键、疏水键等非共价力的作用，形成ES反应中间体，降低过渡态活化能。,2. 酶催化反应机制类型,（1）酸碱催化：过渡态中质子转移的过程。通过酸提供部分质子，或通过接受质子的作用，达到降低反应活化能的过程。 （2）共价催化：催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡中间产物，使反应活化能降低，从而提高反应速率的过程，称为共价催化。 （3）金属离子催化作用：金属离子参与酶促反应。,酸碱催化,过渡态活化能高，异构化速率慢,广义酸碱催化，过渡态活化能降低，异构化速率加快。,共价催化,伯胺亲核进攻乙酰乙酸中羰基碳原子，脱水，形成西佛碱。西佛碱中氮原子带有一个正电荷，使电子云密度发生了有利于脱CO2的变化，从而大大加速了反应的进行。,共价催化,共价催化的催化剂要有高的亲核性能和能形成好的离去基团的能力。 酶中参与共价催化的基团主要有： Asp的羧基, His的咪唑基，Cys的巯基，Ser的羟基等。 某些辅酶，