药品微生物检验现状及药典微生物检查框架课件

药品微生物检验现状及 2010年版药典框架,药品质量标准 【性状】 【鉴别】 【检查】 无菌/微生物限度 【含量测定】,药品微生物检验概况,药品质量体系,安全性,有效性,图1 药品质量体系构成与相互关系,医药产品是人类与疾病斗争的工具。在世界各国的医药实践中，由于药品中污染微生物而引发的悲剧时有发生。 药品中污染的微生物通过微生物体及其分泌代谢产物导致机体过敏、中毒、感染等，严重的可以直接导致菌血症危及生命。此外，某些药品中污染微生物通过代谢活动改变药物组成、破坏有效成份而造成疗效改变或丧失。 所以，世界各国高度重视药品微生物检查，无菌/微生物限度检查均为各国药典中的重要内容。,药品微生物检验概况,我国开展药品无菌检查和微生物限度检查已有数十年的历史。 新中国第一部药典（1953年版）收载了无菌检查法。 我国开展药品微生物限度检查始于1972年。 1978年颁发了第一个“药品卫生标准”。 1995年版中国药典收载微生物限度检查法。 2000年版中国药典收载微生物限度标准。 2005年版中国药典微生物限度检查法引入方法验证实验要求。,药品微生物检验概况,在中央和各地政府有关部门的关怀和重视下，经过我国药品微生物检验工作者几十年来的艰苦奋斗，我国药品微生物检验工作不断发展，标准不断完善，逐步建立起了符合我国国情的药品微生物检验标准体系。 至2010版中国药典，我国药品无菌、微生物限度检查方法和标准在科学性、合理性以及与国际接轨方面均有了长足进展，使我国药品无菌和微生物限度检查步入了一个崭新的时期。,药品微生物检验概况,2006年78月发生了震惊全国的“欣弗事件”！ 2006年11月1日晚，肇事企业安徽华源生物药业有限公司原总经理裘祖贻，在公司办公室自杀身亡。据推测，其自杀原因可能是承受不了“欣弗事件”的重压。 “欣弗事件”至今余震不断，将对我国药品微生物检验及控制工作产生深远的影响！,“欣弗事件”！,技术落后、标准化程度低； 重要性被忽视、事故频繁！ 标准进步与标准化滞后的矛盾,药品微生物检验现状,药品微生物检验的机遇与挑战,从“欣弗”到“刺五加”，频繁的不良事件，把药品微生物检验工作推到一个前所未有的关注高度，提供了发展的机遇； 药品质量事故高发期，如何快速、准确地获得检验结果，又是对当前药品微生物检验工作的一个挑战。,中心任务,把握机遇， 全面推进我国药品微生物检验工作； 迎接挑战， 在突发、应急检验中及时提供一个可靠的检验结论。,建立合理的药品微生物风险评价体系 企业：PAT (Processing Analytical Technology) 建立合理的上市药品监督抽验机制 监督管理部门：以不良反应为先导的国家抽验计划 建立完善的药品微生物检验和控制体系 检验和质控部门：树立微生物检验新理念，检测实验微生物控制体系的认证与监管 生产部门：生产工艺验证和执行监管,药品微生物检验现状,无菌/微生物限度检查理念,微生物检验与微生物控制的关系,图2 药品微生物控制、微生物检验与参数放行,参数放行,中国药典2010年版框架,2010年版中国药典已经编制完成，由中国医药科技出版社出版发行，2010年7月1日正式实施。 2010年版中国药典是新中国成立60年来组织编制的第九版药典，新版药典在总结历版药典的基础上，充分利用近年来国内外药品标准资源，注重创新与发展，实事求是地反映了我国医药产业和临床用药水平的发展现状，为进一步加强药品监督管理提供了强有力的技术支撑。 2010年版中国药典分为三部出版，一部为中药，二部为化学药，三部为生物制品。一、二、三部共同采用的附录分别在各部中予以收载，并尽可能做到统一协调、求同存异、体现特色。,中国药典2010年版框架,2010年版中国药典关于微生物检查有以下主要特点：规定眼用制剂按无菌制剂要求，明确用于烧伤或严重创伤的外用剂型均按无菌要求。中药橡胶膏剂首次提出不得检出致病菌检查要求。新增抑菌效力检查法指导原则、药品微生物检验替代方法验证指导原则、微生物限度检查法应用指导原则、药品微生物实验室规范指导原则等，以缩小附录在微生物方面与国外药典的差距。,中国药典2010年版框架,USP31-Chart10 Microbiological Tests Antimicrobial Effectiveness Testing Biological Indicators-Resistance Performance Tests Microbial Limit Tests() Sterility Tests Microbiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Product Application of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Product Microbiological Evalution of Clean Rooms and Other Controlled Environments Microbiological Best Laboratory Practices Validation of Alternative Microbiological Methods,中国药典2010年版 无菌检查法 微生物限度检查法 灭菌法 抑菌效力检查法指导原则 药品微生物检验替代方法验证指导原则 微生物限度检查法应用指导原则 药品微生物实验室规范指导原则,抑菌效力检查法指导原则,2010年版中国药典一部附录XVIII D 2010年版中国药典二部附录XIX N,抑菌效力检查法指导原则目的,如果药物本身不含有充分的抗菌力，在正常储存和使用过程中可能发生细菌污染和大量繁殖；对患者引起污染或造成药物变质。在生产过程中添加适合的防腐剂以保证药品的质量。 所有防腐剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药品的质量和用药安全，添加防腐剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性，保持最低有效量。 防腐剂效力的测定可为生产过程中添加防腐剂提供指导，随着科学发展，新型防腐剂大量出现，防腐剂效力的测定更为重要；使生产者正确掌握产品中添加防腐剂的效力，有助于选择合适的防腐剂，也可对防腐剂使用的正确性给予评价。,抑菌效力检查法指导原则国内外现状,目前欧洲、美国、英国等国药典均已在附录中收载了防腐剂效力测定，虽然方法不同，但均采用了生物测定方法。我国药典防腐剂效力测定目前还是空白，有必要经过研究，制订出科学、简便、易行的测试方法收载于药典附录中。防腐剂效力的测定，不但为生产者提供正确的使用防腐剂的指导，而且可对使用防腐剂的正确性给予评价。,抑菌效力检查法指导原则基本规定,抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂的确定。 如果药物本身不具有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏和使用过程中可能发生的微生物污染和繁殖使药物发生变质而对使用者造成危害，尤其是多剂量包装的制剂。 在药品生产过程中，抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。,抑菌效力检查法指导原则基本规定,所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。同时，为保证用药安全，最终包装容器中的抑菌剂有效浓度应低于对人体有害的浓度。 在制剂通则中要求具有抗菌活性的制剂，不管是添加的抑菌剂，还是药物本身具有抗菌活性，在药物研发阶段，均应确认其抗菌效力。抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能因药物的成分或包装容器等因素影响而提高或降低，因此，应验证最终容器中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低。 本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准用于包装未启开的成品制剂。,抑菌效力检查法指导原则实验要点,设计实验方案； 验证计数测定方法； 制备浓菌液（108cfu/ml）； 原包装接种； 立即计数与第7、14、28天计数； 计数结果的常用对数值比较； 结果判断。,药品微生物检验替代方法验证指导原则,2010年版中国药典一部附录XVIII E 2010年版中国药典二部附录XIX O,药品微生物检验替代方法验证指导原则,本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定方法用于药品微生物的检验提供指导。 微生物检验的新技术 基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等； 直接测定的被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞计数法、流式细胞计数法等； 基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。,药品微生物检验替代方法验证指导原则,在生物技术和制药行业中，对微生物质量进行控制主要有两方面的工作：过程监控和成品放行。 传统方法的弱点是检验速度慢。利用传统方法所得到的微生物质量控制信息，只能作为产品放行评价的一部分内容，而不能用于及时指导生产过程中的各工艺环节。 替代方法的优点是检验速度快，能够对生产过程的关键工艺环节作出及时的微生物质量评价。 在医药行业完全有必要也有可能使用微生物检验的替代方法,验证参数表,注：表示需要开展 表示不需要开展,药品微生物检验替代方法验证指导原则,验证参数,与国外药典比较，这部分内容有所不同。在定性检验的验证中，借鉴了美国药典的规定，需要开展的验证参数为专属性、检测限、重现性和耐用性，放弃了欧洲药典对准确度和精密度的规定。 在定量检验的的验证中，借鉴了欧洲药典的规定，除检测限外，其他参数均需要验证。,定性检验的方法验证,1、专属性 专属性是指检测样品中可能存在的微生物种类的能力 强调应关注样品存在对检验结果的影响 研究表明，在使用依赖培养技术的替代方法时，样品的存在会导致检验出现假阴性 对于不依赖培养技术的替代方法，样品的存在还可能导致检验出现假阳性 对验证数据可采用2检验,定性检验的方法验证,2、检测限 检测限是指在替代方法设定的检验条件下，样品中能被检出的微生物的最低数量 ，该数量是指在稀释或培养之前初始样品所含有的微生物数量，而不是指检验过程中某一环节的供试液中所含有的微生物数量 验证的关键是确定接种菌的最低数量，与国外药典规定相同，要求该数量应能够在采用药典方法检验时，有50的检出率 对验证数据可采用2检验,定性检验的方法验证,3、重现性 重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批次等）发生变化时，所得检验结果的精密度 ，反映了微生物检验方法在检验结果上抵抗操作和环境变化的能力 验证的关键是使接种菌的量在检测限以上 评价验证结果时，应排除样品均一性的影响 对验证数据可采用2检验,定性检验的方法验证,4、耐用性 耐用性是指当方法参数有小的刻意变化时，检验结果不受影响的能力，为方法正常使用时的可靠性提供依据 对替代方法进行耐用性评价，确定方法操作的关键注意点 在开展了上述评价后，可以不必比较替代方法的耐用性与药典方法的差异 对验证数据可采用2检验,定量检验的方法验证,1、准确度 准确度是指替代方法的检验结果与药典方法检验结果的一致程度。准确度的确认应在检验的范围内。通常用微生物的回收率（）来表示准确度 。 验证的菌浓度应该在检测范围内，并且至少应该有5种浓度以上，每种浓度重复检验5次。 替代方法的回收率应该达到70以上 当替代方法并不依赖微生物生长出菌落或出现混浊来进行定量时，可能出现回收率高于药典方法的情况。 对验证数据应进行必要的数学处理，如对数转换，然后对上述数据采用t检验分析处理。,定量检验的方法验证,2、精密度 精密度是指在检验范围内，对同一个均匀的样品多次重复取样，其检验结果的一致程度。微生物定量检验的精密度通常采用标准偏差或相对标准偏差（变异系数）来表示 。 验证的菌浓度应该在检测范围内，并且至少应该有5种浓度以上，每种浓度重复检验10次。 可以接受的相对标准偏差（RSD）应不大于35。在该项目上，USP 的规定是1535，研究表明，当含菌浓度在30300cfu/ml时，计数结果的RSD完全可能在15以内，因此，指导原则中对该指标作了修改。 替代方法的相对标准偏差（RSD）应不大于药典方法 。 对验证数据可采用t检验分析处理。处理时，应分别评价每种浓度下两种方法计数结果的差异以及两种方法在不同浓度下获得的RSD值的差异。,定量检验的方法验证,3、专属性 专属性是指通过检测适宜的试验菌，以证明检验方法与其设定目的相适应的能力。 例如，菌落计数平皿法其设定目的在于检出一定数量的微生物，则其专属性验证应证明当样品中存在一定数量的试验菌时，通过平皿法检验，能够检出试验菌，而样品的存在不会对结果造成影响。 验证的关键是合理评价样品的存在对检验结果的影响，当替代方法不依赖微生物生长出菌落或出现混浊就可以定量时 ，这种评价显得尤为必要。 对验证数据可采用双因素方差分析的方法进行统计分析，以确定不同样品间以及两种方法间是否存在差异。,定量检验的方法验证,4、定量限 定量限是指样品中能被准确检验的微生物最低数量。 验证的关键是在检验范围的低限，选择尽可能低的5种菌浓度，每种浓度重复测定5次，替代方法的定量限不得大于药典方法。 对验证数据可采用t检验分析处理。,定量检验的方法验证,5、线性 线性是指在检验范围内，检验结果与样品中微生物数量成比例关系的程度。 线性验证时必须覆盖检验的范围。 在对验证数据进行处理时，应以样本中预期的菌浓度为自变量，以不同方法的计数结果为应变量，进行线性回归分析，计算相关系数，不得低于0.95。 6、范围 范围是指能够达到一定的准确度、精密度和线性，检验方法适用的高低限浓度或数量的区间。,定量检验的方法验证,7、重现性 重现性是指相同的样品在正常的实验条件（如实验场所、实验人员、仪器、试剂的批