疫学E玫瑰花环形成实验.ppt

实验三 E玫瑰花环形成实验,玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体，所以不能形成E玫瑰花环，以资鉴别,实验目的,练习取外周血 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法 学习E花环试验的操作方法 观察显微镜下E花环的形态,实验原理,本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.0740.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。,实验原理,人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验(erythrocyte-roseette formation test)。 应用最广的有总E花环试验(Et,t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea,a为active 的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。,实验原理,E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。,实验原理,T细胞,SRBC,E受体（CD2),E玫瑰花环实验判断细胞免疫功能,T淋巴细胞玫瑰花结电镜照片,T淋巴细胞玫瑰 花结示意图,实验步骤,1.抽取人外周血2ml置于肝素抗凝管中，再加2ml的Hangs液稀释（动作要快）； 2.用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰 （动作缓慢），以2000rpm 离心20分钟，离心后分为4层。 3.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处淋巴细胞层（灰白层）至一刻度离心管内。 4.加入3ml的Hanks液吹打混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀主要为淋巴细胞 。,稀释的血液,分离液,离心,稀释的血液,分离液,实验步骤,5，取0.1ml淋巴细胞悬液，加入等量1RBC悬液，1000rpm离心5min，取出. 6，用手指轻弹试管来轻悬沉淀（不能吹打），取一滴滴加在载玻片上，显微观察。,人静脉取血,四个同学一组； 严格无菌操作（消毒由中心想外周，半径2-3cm，手不能碰触针头金属部分）； 绑好止血带（肘上5-6cm，两端向上）右手持注射器刺入静脉（枕头斜面向上成15-30角，扎入后平行前进），徐徐抽取血液，达所需量时，拔出针头，用无菌棉球压迫止血。 静脉血立即注入肝素管中（除去针头后再向试管加血，防止细胞破坏）。,实验结果,计数花环个数，结合3个以上的SRBC为一个花环，计算活性E花环形成率，正常值为50%-80%。 E花环形成率 形成花结的淋巴细胞数 /淋巴细胞总数 （形成花结+未形成花结）100% Et（总E花环：放入4冰箱中过夜8h后的结合率）：60%-80% Ea（活性E花环：能立即与绵羊红细胞结合的，活性较强）： 2