肿瘤细胞培养技术林星石.ppt

肿 瘤 细 胞 培 养 技 术 解放军总医院免疫室 林星石研究员,Histroy,肿瘤类型：间充质 上皮 神经外胚层 造血源性（1955-1958-1963-1965） In vitro: 原代 传代 建系（1967-1970） 配基成分：纯血清 含血清 无血清 生物学特性：细胞 亚细胞 酶和分子,肿瘤细胞in vitro的特点,细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 逐渐一致 增殖力更强：DNA合成期、分裂期达50% 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制高分化 变低分化 表面性状：负电荷数量正常，贴壁性，抗原性可 变异 接触抑制减弱或消失： 悬浮生长特征： 成瘤性：移植到动物体内可成瘤,肿瘤细胞in vitro 培基,RPMI1640：最常用，+1020%FCS，上皮性 或悬浮性（+0.03%谷氨酰胺） DMEM：常用 F12： 适用于上皮性癌，如肝癌， L-15： 注意：+2g/L NaHco3 或 +20mmol/L HEPESpH7.2 RPMI1640+F12或L-15（1:1）：适用肉瘤,培养液特殊添加剂,常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂 终浓度 添加剂 终浓度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氢化可的松 10-5mol/ml,肿瘤细胞的培养,与常规细胞培养技术相同 一个细胞群体，存在多种亚群，复杂性 建株细胞较正常细胞易于培养,细胞分裂增殖的调控 （细胞周期）,多种基因的协同作用 调控因子： 基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的调控 胸苷激酶的调控 负调：DNA损伤与DNA修复：抑制抗性 肿瘤细胞,细胞间的相互影响,不同亚群代表不同分化程度的细胞群 表型、形态、受体、对因子的反应等 均不同 不同亚群释放不同的正负调节因子 (阴阳调控),细胞因子与激素对肿瘤细胞的调控,一个重要而复杂的因素 因素 高分化 低分化 胰岛素 生长 - 凝血孝素 生长 - 前列腺素 促进（400) 抑制 激情素 - 助黏附 维生素A 抑制生长及分化 _ 调整培基中的成分可调控细胞的生长与分化,影响培养肿瘤细胞生长的因素,PH 营养：如血清效价低 细胞生长因子的自分泌及旁分泌 癌基因抑癌基因的变化 排泄废物的影响 细胞外基质的作用 细胞相互间的作用 污染,培养技术 - 取材,手术标本 活检标本 胸腹水穿刺 细针头穿刺 内窥镜活检 关键：新鲜、无菌、及时、准确,技术- 分离纯化,分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分离 纯化：反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型 流式细胞仪分选 克隆建株 高转移株的建立：反复接种,技术-培养,原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞， 防止细菌、真菌污染。 传代培养：增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度, 基本长满后 传代, 前10代不稳定，注意 培养条件，适当调整培基。,技术- 鉴定与建株,鉴定：组织来源 、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致瘤实验（裸小鼠） 建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况 注意：不是每一肿瘤组织都能建株,应用- 肿瘤治疗的研究,治疗药物敏感性的鉴定与筛选 肿瘤的多药耐药性的鉴定 各种新药治疗的实验研究 体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放） 体内：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生长率、转移率、生存时间及死亡率 作用机理的研究：基因、蛋白、酶、标志、受体,肿瘤细胞培养的应用,肿瘤细胞的遗传特性：各种癌基因及抑癌基因的分析、染色体定位（FISH法） 肿瘤细胞的生物学行为：细胞周期（FACS)、信号传递 肿瘤细胞的标志与激素、受体变化（免疫细胞化学、放射自显影、酶免疫、荧光免疫、放射免疫、免疫印迹）,单克隆抗体的制备,单克隆抗体的制备, 基本原理：Bunet抗体选择学说，每个B细胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成的纯细胞系，称为克隆。,单克隆抗体的制备, 单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株克隆系产生的抗体 单克隆抗体（McAb)。 1975年Kohler 和 Milstein 首先利用细胞融合技术制备了永久分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。,单克隆抗体的制备,特点：肿瘤细胞易体外培养和长期生长； B淋巴细胞 分泌特异性抗体； 二者杂交融合杂交瘤，继承二者性质。 HAT培基：H次黄嘌呤、 A氨基蝶呤 T胸腺嘧啶核苷,单克隆抗体的制备,肿瘤细胞DNA合成途径： 叶酸衍生物 氨基酸、小分子化合物合成DNA HGPRT -TK 次黄鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 核苷酸前体,单克隆抗体的制备,HAT特点：“A” 叶酸拮抗物 骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途径阻断；缺HGPRT， 不能利用“H”死亡。 脾细胞-脾细胞：有HGPRT，缺增殖能力死亡。 骨髓瘤-脾细胞：HGPRT+无限增殖能力 存活。,单克隆抗体的制备方法,抗原：纯度、分子量。 1. 细胞12107 2. 可溶性蛋白质抗原10 100 g 动物：BALB/C鼠，周龄：68周，雌性 佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、脂质体,免 疫 方 法,1.常规免疫：腹腔或颈部多点皮下 0 天：基础免疫抗原+完全佐剂 15天：基础免疫抗原+不完全佐剂 30天：基础免疫抗原+不完全佐剂 45天：追加免疫同量抗原 48天：进行细胞融合,免 疫 方 法,备注： 1. 细胞、细菌、病毒等颗粒性抗原有较强抗原性，可不加佐剂，直接腹腔注射。 2. 可溶性蛋白质抗原需加佐剂。 本研究室经验：,免 疫 方 法,2. 脾内免疫： 2.1 0 天：基础免疫 15 天：脾内免疫 18 天：细胞融合 2.2 0 天：脾内免疫 4 天：细胞融合,免 疫 方 法,脾内免疫 优点：时间短，使用抗原量少。 可溶性抗原：210g 细胞抗原：1 105 缺点：效果差于常规免疫，尤其无基础免 疫的脾内免疫。,免 疫 方 法,脾内免疫方法： BALB/C小鼠乙醚麻醉，右卧位，消 毒，无菌操作剪开皮肤，透过腹膜，用 4 号针头注射器注入脾脏，尽量刺深，勿刺 透，纵轴方向，边退边注射或多点注射。 注意事项： 抗原体积 0.2 ml，脾内逐步注射后， 针头拔出口时要停留片刻， 缝合切口或用 医用黏合剂涂抹切口。,免 疫 方 法,3 . 弱免疫原免疫方案； 0 天：基础免疫 30 天：基础免疫 45 天：基础免疫 60 天：基础免疫 75 天：基础免疫 6个月内，至鼠血清测出抗体产生。静脉 或脾内追加免疫后7296h细胞融合。,免 疫 方 法,4. 体外免疫： 分离小鼠脾细胞，置 10% 20% FCS RPMI1640培基，加适量滋养细胞与抗原 （可溶性抗原 0.5 5 g/ ml；细胞性抗原 10 5106/ ml），37，5%CO2 培养 3 天， 再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞，融合。,单 克 隆 抗 体 制 备,一.滋养细胞制备： 1. 机制：不明，通常认为这类细胞释放 一种或几种生长因子，提供必要生长 条件。 2. 小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞 正常无感染BALB/C小鼠，处死。 75%乙醇浸泡 510min，,单 克 隆 抗 体 制 备, 撕开腹部皮肤， 充分暴露腹腔， 提起 腹膜，剪开，吸管注入5 ml无血清培基， 小心提动或轻揉腹膜， 吸出培基。 无血清培基洗2次，细胞浓度2105/ml, 0.1 ml / 孔/ 96孔，相当于 2104。通 常获2106 5106 只。,单 克 隆 抗 体 制 备,二. 骨髓瘤细胞准备：Sp2/0, NS-1等 1. 复苏，20%FCSRPMI-1640培基为好。 2. 培养、传代，取对数生长期细胞（1105 5 105/ml），按1：5 1：10 稀释传代，2、3天扩大培养，选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。 3. RPMI-1640培基洗3次（1000r/min 5min ),单 克 隆 抗 体 制 备,注意事项： 1. 骨髓瘤细胞的细胞活数应在95%， 2. 无各种污染， 3.骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。,单 克 隆 抗 体 制 备,三. 免疫脾细胞悬液制备： 1. 免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。 2. 浸泡于75%乙醇515分，入超净台，打开腹腔（逐次换器械），取脾。 3. 剪碎脾脏，注射器内芯研磨过100目钢筛， 平皿预先23ml RPMI-1640，移入圆底试管，补加适量培基，静置35分，取上2/3悬液移入50ml离心管，上述反复23次。,单 克 隆 抗 体 制 备,三. 免疫脾细胞悬液制备： 5. 上述培基洗细胞2次（ 1000r/min 10 min ）， 6. 不完全培基10ml重悬液，台盼蓝计数活 脾细胞数，1 10 8 2.5 10 8 /只。,单 克 隆 抗 体 制 备,四. 50%PEG的准备： 融合前，称PEG（mw = 4000) 2g，置小 瓶内，低压消毒（8磅），15min, 取出立即 边加边摇加入2ml完全培基，（内含0.3%ml二 甲基亚枫，以提高融合率），至完全混合，4 保存。用前37 预热。要求PEG现配，防止 PH变碱。,单 克 隆 抗 体 制 备,五. 细胞融合： 1. 将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于 50ml离心管内（脾细胞1 10 8，骨髓瘤细胞1 10 7）。用SP2/0时，脾细胞：骨髓瘤细胞以10：1为好；用NS-1，脾细胞：骨髓瘤细胞以5：1为好。,单 克 隆 抗 体 制 备,2. RPMI-1640培基洗2次（1500r /min/8min）； 3. 倾倒上清，吸尽残留液，轻弹管底， 使细胞 疏松，离心管移至超净台预先放置的37 水浴。 4. 1 ml 吸管吸取 0.8 ml 37 PEG，110 8 脾细胞+ 0.8 ml PEG，边加边摇，60s内加完， 轻摇1.5 min。5 min内摇动缓和加入10 ml 预 温37 的RPMI-1640。,单 克 隆 抗 体 制 备,注意： 第1 min 加 1 ml; 第2 min 加 1 ml; 第3 min 加 1.5 ml; 第4 min 加 1.5 ml; 第5 min 加 5 ml; 再补加40 ml。 离心：1000r / min / 5min.,单 克 隆 抗 体 制 备,5. 移出上清，取少量HAT小心吹散细胞，细 胞移入HAT培基中，按免疫脾细胞210 5 / 孔/96孔， 加入 0.1 ml 0.2 ml/孔（已加入融合当天 制备的滋养细胞）， CO2 孵箱 37 。 提示： 接种1012块96孔板，使80%杂交瘤生长为 单克隆，减少克隆化次数，阳性孔不易丢失。,单 克 隆 抗 体 制 备,六. 融合细胞观察与换液： 1. 第23天骨髓瘤细胞退化、核缩、碎裂， 增生、吞噬碎片；第45天可见小堆 杂交瘤细胞生长。记录。 2. 融合后57天确认骨髓瘤细胞全部死亡， 毛细吸管吸出0.1ml 0.15ml HAT， 换成同量HT培基。,单 克 隆 抗 体 制 备,七. 杂交瘤抗体检测： 培基变黄，杂交瘤细胞占孔底面积1/4、状 态好，可测上清液抗体（非分泌性比分泌性杂 交瘤长速快），及时测抗体及时克隆化，以免 目的杂交瘤丢失。 测定时间：融合后1015天，第次换液3 天后，ELISA、冰冻切片荧光技术等。 阳性孔杂交瘤转入24孔板，1天后细胞状态 好即可克隆化。,单 克 隆 抗 体 制 备,八. 克隆化：有限稀释法。 1. 按前述准备新鲜滋养细胞用HT培基接种 96孔板，0.1ml/孔。 2. 向24孔板加0.9 ml/孔HT，通常每个待克隆杂交瘤需34孔。 3. 用1ml吸管吹散待克隆的杂交瘤细胞，取适量加入含0.9mlHT24孔板第孔，混匀，吸 0.1ml加入第孔，同法稀释第3孔、第4孔。 4. 混匀第1孔细胞计数。,单 克 隆 抗 体 制 备,5. 计数后从相应孔取100个细胞（如第3孔细胞 计数为1.210 3，则从第3孔取100/1.2 103 0.083ml），加入10ml HT，接种预先加入滋 养细胞96孔板