真菌多糖的生理活性.ppt

真菌多糖的生理活性、研究技术,谢辉 2008.3.27,主要内容,真菌多糖的概述 真菌多糖的生理活性 真菌多糖的提取纯化技术 真菌多糖的结构分析 应用前景,真菌多糖的概述,真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的，具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗肿瘤、免疫调节、延缓衰老等多种生物活性，现已被开发成多种药物和功能性食品添加剂。近年来，真菌多糖及其复合物的研究引起越来越多的关注。,真菌多糖的概念,真菌多糖是一类天然高分子化合物，它广泛存在于真菌的细胞壁中，是由醛基和酮基通过糖苷键连接起来的高分子聚合物。有螺旋状的三维立体结构，其构型近似于DNA，是一种型的多糖。也是控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖。因其进入体内后不会被消化、分解、吸收，能够和细胞膜上的受体结合，从而能发生药理活性。因此，是一类具有广泛药理活性的功效十分显著的活性物质。,真菌多糖一般分为胞外多糖和胞内多糖，高等真菌多糖主要是胞内多糖，它主要存在于菌丝体的细胞壁或细胞间质中，通过普通粉碎不能提高其含量的是胞外多糖，反之则是胞内多糖。,真菌多糖的分布,真菌多糖主要分布于真菌的菌丝、子实体及其发酵液中。在不同的部位含量有所不同，在真菌的菌丝体的细胞壁和细胞质中存在较多，其他地方较少。故真菌多糖主要是在菌丝体细胞壁和细胞质中提取。,真菌多糖的生理活性,真菌多糖具有降血压、血脂、健胃保肝、抗氧化、延缓衰老、抗感染、抗辐射、促进核酸和蛋白质的生物合成，修复损伤的组织细胞等多种功效。真菌多糖的抗肿瘤作用是目前所知其最为重要的生物活性，也是研究最为活跃的部分。,真菌多糖的抗氧化、抗衰老活性 真菌多糖的抗肿瘤活性 真菌多糖的免疫调节 真菌多糖的抗突变作用 真菌多糖的降血糖作用 真菌多糖的抗病毒作用 真菌多糖的健胃保肝作用,真菌多糖的抗氧化、抗衰老作用,许多真菌多糖都具有提高抗氧化酶活性，清除自由基，抑制脂质过氧化，从而保护生物膜的作用。关于其作用机理有以下4 个方面: 加强DNA 的复制与合成，提供必需的微量元素与营养来延长动物的生长期。提高动物对非特异性刺激的抵抗力以达到强壮作用。通过调节和增强免疫功能达到抗衰老作用。调节蛋白质、核酸、糖、脂质代谢，抗脂质过氧化，提高机体SOD 比活力，清除LPO 和MDA ，以抗衰老。,真菌多糖的抗肿瘤活性,多糖的抗肿瘤功能一般表现为多糖能提高机体免疫力或能够激活和提高网状内皮细胞、巨噬细胞的吞噬能力，直接杀灭肿瘤细胞，能促进干扰素和白细胞介素的产生而抑制肿瘤的生长。已有多种真菌多糖，如云芝多糖、香菇多糖、裂褶菌多糖和茯苓多糖，在临床上用于治疗肿瘤。,真菌多糖作为抗癌剂的最大优点是毒副作用小，与化疗联合应用有协同作用，还可对抗化疗药的骨髓抑制等不良反应。其中香菇多糖、猪芩多糖、裂褶多糖与茯芩多糖己用于临床，在治疗中显示出对多种肿瘤细胞的抑制能力，如香菇多糖治疗胃癌、结肠癌、乳腺癌、淋巴肉瘤等取得了较好疗效，存活期明显延长，几乎无副作用。 茯芩多糖腹腔给药，可明显抑制小鼠S-180和移植性皮下肿瘤生长。动物实验表明，茯芩多糖与环磷酞胺、5-Fu、争光霉素、长春新碱等化疗药物合用于多种移植性肿瘤，有明显的增效作用，对S-180的抑制率可达96.68。,猪芩多糖可作为临床上延长恶病质患者生命、提高其生存质量的一种有效药，可抑制毒激素-L在诱导肿瘤恶病质中的作用，而毒激素-L与肿瘤恶病质密切相关；对小鼠移植性肉瘤S-180有明显抑制作用，瘤体抑制率为50%70，瘤重抑制率在30以上，20mgkg剂量时对小鼠肉瘤S-180的抑制作用较门本云芝多糖大25倍且稳定。 香菇多糖对小鼠移植性肿瘤也有明显抑制作用，对S-180、H22抑瘤率分别为43，47；小金针菇多糖对S-180、H22、Lewis有明显的抗肿瘤活性，其抑瘤率与云芝多糖相似，能抑制肿瘤生长，使肿瘤坏死程度增加，且使肿瘤组织酸性非特异酯酶活力下降,真菌多糖的免疫调节作用,实验证明，大多数真菌多糖的抗肿瘤作用是作为生物反应调节剂，通过增强宿主免疫调节功能即宿主介导抗肿瘤活性来实现的。真菌多糖可通过多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用。大量免疫实验证明，真菌多糖不仅能激活T、B 淋巴细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞（NK）等免疫细胞，还能活化补体，促进细胞因子的生成，对免疫系统发挥多方面的调节作用。,在目前已发现的多糖化合物中，绝大多数的多糖均具有免疫调节功能，具有激活或提高网状内皮细胞和巨噬细胞的吞噬能力、活化T 淋巴细胞和B淋巴细胞、激活补体、促进干扰素的产生、促进白细胞介素的产生等作用。如香菇多糖、猴头菌多糖、雷丸多糖、裂褶菌多糖、猪苓多糖、云芝胞内多糖等。,真菌多糖的抗突变作用,近年来，随着大量科研工作的实施，真菌多糖抗突变方面的研究取得了很大成果，但多糖本身结构的复杂性给研究工作带来一些困难。真菌多糖对细菌、高等植物细胞、动物细胞的突变具有拮抗作用，因此，多糖应用的范围广泛。另外，细胞突变与肿瘤的产生和预防有密切关系，进行真菌多糖抗突变研究有利于尽快突破肿瘤预防和治疗的世界性难题。,目前在真菌多糖抗突变研究中使用的方法：沙门氏菌回复突变试验（Ames 试验）、微核试验、小鼠的染色体畸变试验（包括小鼠睾丸染色体畸变、骨髓细胞染色体畸变和脾脏染色体畸变等）、小鼠精子畸形试验等。,真菌多糖的降血糖作用,研究发现，银耳多糖可降低高胆固醇血症小鼠血清胆固醇含量，并随剂量加大而增强。银耳孢子多糖可使血清中TC、French、ChE、TG、% LP含量明显降低。香菇多糖可促进胆固醇代谢而降低其在血清中的含量。灵芝水提物能防止注射肉毒素诱发播散性血管内凝血大鼠的血小板和纤维蛋白质减少，延长前凝血酶原时间，增加纤维蛋白降解产物，防止肝静脉血栓形成。,竹荪多糖、双孢蘑菇中的酪氨酸酶对降低血压是十分有效的。冬虫夏草多糖对心律失常、房性早搏有疗效，灵芝多糖对心血管系统具调节作用，可强心、降血压、降胆固醇、降血糖等。姬松茸多糖能降血脂、提高耐氧能力。真菌多糖可增强冠体流量与心肌供氧、降低血脂、预防动脉粥样硬化斑的形成。,真菌多糖的抗病毒作用,大多数多糖对各种病毒有抑制作用，如艾滋病毒（HIV-1）、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒等。香菇多糖对泡状口角炎病毒感染引起的小鼠脑炎有显著治疗和预防作用，治疗组100存活，而对照组全部死亡；香菇多糖对防阿伯尔氏病毒和十二型腺病毒感染也有效，其抗病毒作用与它诱生IFN和提高NK活性有关。多糖的抗病毒作用现已引起医药界的高度重视，显示了多糖广阔的药用前景。,真菌多糖的保胃保肝作用,猴头菌多糖可增加骨液分泌、稀释胃酸、保护溃疡面、促进粘膜再生，对胃癌、慢性萎缩性胃炎、食道癌、十二指肠溃疡有显著疗效。云芝多糖对慢性肝炎、乙型肝炎皆有防治作用。香菇多糖提取物有保肝、增强排毒能力以及增强对洋地黄毒素毒性的抵抗能力。,真菌多糖的提取纯化技术,真菌多糖的提取 真菌多糖存在于食(药) 用真菌的菌丝体和子实体中，食(药) 用真菌菌丝在液体发酵时，有的将多糖分泌到胞外，形成胞外多糖；有的只留在胞内，形成胞内多糖。若直接食用不易达到保健治疗作用，只有将其有效成分提取和纯化，才能提高功效。真菌多糖多以氢键、盐键等与其它多糖聚合在一起， 因而须以各种有效方法破坏多糖链与其它物质的共价结合，方能达到提取多糖的目的。,大多数真菌多糖不溶于冷水，在热水中呈黏液，遇乙醇能沉淀。因此，从真菌中分离、提取较为单一的多糖，并鉴定其纯度极为困难。一般是根据原料的差别及对多糖品质要求的不同而采用不同的方法。目前，提取多糖常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法和冷热稀碱提法。其中水提法被采用得较多， 适合于提取水溶性多糖；稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖，提取时间宜短、温度不超过50 ，以防止糖苷键断裂；稀碱法适合于提取碱溶性糖。,大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4-5 倍的低级醇和丙酮，一般在pH 值为7.0 左右沉淀，制得粗多糖。由于水提时间长且效率低，酸碱提取易破坏多糖的立体结构及活性，而采用酶法提取真菌多糖（用复合酶与热水浸提相结合的方法），具有条件温和、杂质易除及提取率高等优点。另外，华南理工大学轻工食品学院于淑娟等人（1995 年）对真菌多糖的超声波催化酶法提取进行了研究。结论指出，与传统工艺相比，超声波催化酶法操作简单、提取率高，反应过程无物料损失和无副反应发生。,超声技术提取 超声波作为一种提取技术已有报道，它具有时间短、效率高、提取量高等特点，同时可防止提取物在长时间、高温条件下发生降解、褪色等变化。超声波协同纤维素酶提取真菌多糖的方法，通过空化、振荡等作用，使酶分子构象及催化部位微环境发生变化，从而影响纤维素酶的催化活力。此外，低强度超声不仅可使细胞周围形成微流， 还可使动植物细胞产生胞内环流，从而提高了细胞膜和细胞壁的通透性，利用这一特点可达到加快细胞壁释放多糖的速度、缩短提取时间、提高多糖提取率的目的。,微波法提取 微波是另一种新的真菌多糖提取技术，微波技术是近几年来用于天然植物有效成分提取的一项新技术，它具有快速、高效、安全、有效成分得率高、节能等特点。据报道有人采用微波技术应用于板蓝根多糖的提取，结果表明，粗多糖得率和多糖质量分数均明显高于单独使用水煎煮法。说明微波浸提法是一种简便、快速、高效、低能耗的提取方法，值得推广应用。,真菌多糖的纯化 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。 纯化方法 （1）分步沉淀法: 根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮进行分步沉淀提取。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。 （2）盐析法: 根据不同多糖在不同浓度盐溶液中具有不同溶解度而分离。,除杂质 真菌多糖提取物中往往混有蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。蛋白质一般常用醇析法和Sevag法、三氟二氯乙烷法等除去；真菌多糖的色素大多呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用DEAE-纤维素或DuoliteA-T来吸附色素；低聚糖等小分子杂质可通过逆向流水透析法除去，然后可通过分部沉淀法、柱层析法、超过滤法等方法进行纯化。,真菌多糖提取物纯度的检测 经分离纯化后的真菌多糖需要进行纯度鉴定。现在常用的纯度鉴定方法有高效液相色谱法、超离心法、高压电泳法、旋光测定法、凝胶层析法和高压液相法等。值得指出的是，纯度检查一般要求有上述两种方法以上，其结果才能肯定。 分子量的测定 一般测定的多糖分子量是总分子量。测定方法有葡聚糖凝胶柱层析、凝胶电泳、高压液相色谱法、超离心法、改良型膜渗透法和高效凝胶渗透色谱法。,真菌多糖的结构分析,成分分析 真菌多糖分结构多糖和活性多糖。真菌细胞壁中往往含有几丁质，为一类聚氨基葡萄糖，属于结构多糖；另一类活性多糖是由真菌菌丝体产生的一类次生代谢产物，研究这类多糖对真菌本身作用较少，一般认为是真菌储存能量的载体之一， 而对它们的药理活性研究得较多， 因此把这一类多糖称为活性多糖。 多糖的结构 真菌多糖的结构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。,一级结构 一级结构是指其单糖残基的组成、排列序列、连接方式等。真菌多糖的一级结构主链主要有2 种： （1）葡聚糖：(13)糖苷键连接为主，并兼有少量(14)或其他糖苷键，香菇多糖、茯苓多糖、云芝多糖等都属于这种连接；(16)糖苷键连接的低聚葡萄糖；(13)糖苷键连接的低聚葡萄糖。 （2）甘露聚糖: 主要有-糖苷键连接的甘露聚糖，如银耳多糖的主链结构是由(13)糖苷键连接的甘露聚糖，侧链由葡萄醛酸和木糖组成。,真菌多糖的二级结构 二级结构是指多糖骨架链间以氢键结合形成的各种聚合体，这只是关系到其分子主链的构象， 而不涉及侧链的空间排布。 三级结构 三级结构是指由多糖中糖残基中的羟基、羧基、氨基及其他功能团，通过非共价作用而形成的有序、规则而粗大的空间构象。 四级结构 四级结构是指多糖多聚链间以非共价作用力而结合形成的聚集体。,多糖一级结构的分析方法 对于多糖一级结构， 传统的分析方法是用化学分析法。多糖样品用酸全部水解后，经纸色谱或薄层色谱与标准样品对照，并用气相色谱法测出多糖的相对含量。通过甲基化、Smith 降解和高碘酸氧化等确定多糖中单糖的连接点，然后用酶降解，逐步测出糖链顺序，用凝胶渗透色谱法测出多糖的平均分子量。这种方法所需要的样品量大，操作繁杂、费时，且分析精度不高。,现代仪器分析法是在化学分析法的基础上更进一步地了解和研究多糖结构特性的方法。与化学分析法相比，现代仪器分析法具有快速、准确、灵敏和操作方便等优点。目前，在此方面应用较多的有紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）、核磁共振法（NMR）及电泳等。其中IR法和MS法是多糖结构分析的有效手段，而NMR法在解决糖的立体化学方面起着重要的作用。,多糖的高级结构分析 多糖的二级结构分析常用的手段是NMR技术。缪振春等人采用一维SEMDY和旋转坐标NOE 差谱NMR新技术相结合的方法，对从四川九节龙的正丁醇提取物中分离得到的四糖皂苷进行了分析。另外在多糖的三维结构测定中，X-射线衍射分析是较好的方法。,构效关系 活性多糖的化学结构是其生物活性的基础。多糖的构效关系就是指多糖的一级结构和高级结构与其生物活性的关系，是当前糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题。可能是因为多糖的结构过于复杂，从总体上看，对多糖构效关系的研究很不完善。 就多糖一级结构与其生物活性的关系而言，一方面多糖的糖组成和糖苷键类型对其生物活性有一定的影响，如从菌体中获得的活性多糖一般是由葡萄糖构成的，而且葡萄糖主链上的-1,6 糖苷键是抗肿瘤所必需的。,对具有抗病毒活性的硫酸酯化多糖而言，硫酸酯化均多糖的活性大于硫酸酯化杂多糖，且-1,3-D-葡聚糖和以-1,3-D-葡聚糖为主的多糖活性明显高于-1,6-D-葡聚糖。 多糖一级结构对其生物活性影响的第2 个方面是多糖中的一些官能团。多糖中的官能团种类或有无官能团对其生物活性有极大的影响，而这些官能团往往可以通过一定的化学方式进行添加或消除，所以多糖中官能团的改造已成为研究多糖构效关系的有力手段。常用于多糖官能团改造的方法有降解、羧甲基化、硫酸酯化、乙酰化、烷基化、磷酸酯化、二乙基氨基乙基化、碘化和氨化等。,对不同的多糖来说，不同官能团改选方法对其生物活性的影响各不相同，除了大多数硫酸酯化多糖具有明显的抗病毒作用外，其他官能团对多糖生物活性的影响尚无规律可循，这无形之中增加了多糖构效关系研究的难度。 多糖的高级结构与其生物活性的关系至今尚不十分清楚，但高级结构比一级结构在活性方面起更大的决定作用，学者对于这一观点是达成共识的。有些多糖具有相同的一级结构，但活性大不相同，这主要是由其高级结构的差别引起的。,应用前景,应用 真菌多糖以其多方面的生物活性和安全无毒副作用而备受青睐，人们近年来开始重视真菌多糖的开发，国内外对真菌多糖的开发利用发展很快。由于其显著的生物活性，且几乎没有任何毒副作用，所以许多真菌多糖被用作保健食品的功能添加剂。研制出一系列药品和保健品，在传统的丸、汤剂基础上又开发了针剂、冲剂、片剂、胶囊、糖浆乃至保健口服液、饮品、速溶茶、酒饮料等各种产品。目前市场上投放的真菌多糖类保健品有上百种之多。如真菌多糖啤酒已在我国问世。,真菌多糖作为保健食品和药品已为人们所认识，人们已开始重视真菌多糖的开发，尤其在生物活性方面。国际上食、药用真菌的医疗保健品走俏， 正朝抗癌、增寿、强身、益智、美容以及提高免疫力和防止衰老等为特点的系列制品开发。茯苓多糖已制成片、针剂用于临床，为癌症化疗的辅助治疗剂，并已成为治疗慢性乙型肝炎的良药之一。 随着对食药用真菌多糖生物活性研究的深入，食药用真菌多糖的应用也取得一定的进展。,泰山制药厂生产的灵芝多糖口服液已经证实能使老龄小鼠红细胞、肝、脑组织中SOD 活性增高，使心、肝组织中MDA 含量减少，具有良好的抗衰老作用。该口服液还可使环磷酰胺所致的免疫抑制的小鼠免疫功能恢复至接近正常水平，具有一定的免疫调节作用。 PSP（云芝糖肽）是从药用真菌云芝深层培养菌丝体中提取的结合蛋白多糖，具有抑制