Ⅳ酶的提取与分离纯化.ppt

酶的提取与分离纯化,重点,一 酶的下游加工流程,1.预处理 2.细胞过滤分离 3.酶提取 4.酶分离纯化 5.酶浓缩、结晶、干燥 6.酶保存 7.酶制剂成型 酶工程下游技术操作条件,二 预处理,1.加热：使温度达到最适温度 2.凝聚，絮凝 3.加酸碱：达到最适PH,三 细胞过滤分离,1.细胞破碎法 机械破碎法：研磨、搅拌、匀浆 物理破碎法：温度差法、压力差法、超声 波空穴效应 化学破碎法：酸碱，有机溶剂破坏细胞壁、膜 酶破碎法：加酶破坏细胞壁、膜；最适条件培 养，使溶酶体破裂自溶 2.过滤方法：加压、常压、减压过滤法 空穴效应：超声波使发酵液中产生许多小气泡， 气泡破裂产生内爆力使细胞破碎,四 酶提取,1.本质：使胞内酶溶解到发酵液中，使酶出 细胞 2.方法：盐溶法，有机溶剂溶解法，PH远离 PI 3.条件：T：0oC-10oC PH：酶活力范围内，远离PI 提取液体积：酶液体积的2-5倍,酶工程下游技术操作条件,T：0-10oC低温 PH：根据要求,远离或趋近PI 加酶活保护剂：有机溶剂提取、沉淀分离时 防酶失活,五 酶的分离纯化,沉淀分离 膜分离 离心分离 层析分离 电泳分离 等电点分离,沉淀分离,一 盐析法 1.原理:高浓度(NH4)2SO4中和蛋白质表面电 荷,使同电相斥作用减小凝聚沉淀 2.,二 等电点法沉淀分离,1.原理:PH=PI时,带电量为零,同电相斥作用 最小,凝聚沉淀 2.注意：等电点法不破坏水膜，不一定沉 淀，须与其他方法联合使用,三 有机溶剂沉淀法,1.原理:有机溶剂破坏蛋白质三级结构,使非 极性基团外露,极性基团内藏,使水膜 破坏,凝聚沉淀.,膜分离法,一 压差膜法 1.纳滤： 2.微滤： 3.超滤：,二 电位差膜法（电渗法）,1.定义：用两块膜把水槽分为三个室，加空 间电场，使中间室中待分离液中正、 负离子分别电渗到两边的两室 2.注意：正离子向靠近负极的室电渗 负离子向靠近正极的室电渗,三 扩散膜法,1.定义：将待分离液装入膜袋中，膜袋外为 浓度大于或小于待分离液的溶液。 利用浓度差使待分离液中水、杂质 通过渗透或渗析而与需要的组分分 离 2.渗透与渗析 渗透：只有溶剂透过膜 渗析：有溶质透过膜,四 膜的选择,1.透水率： 2.截留率： 3.截留物相对分子量：,离心分离,一 离心机的选择 1.常速离心机：Vmax8000r/min； 用于： 2.高速离心机：Vmax（1-2.5）104r/min； 用于： 3.超速离心机：Vmax（2.5-12）104r/min； 用于：生物大分子、,二 离心方法,1.差速离心法：利用密度（质量数）不同的 物质离心速度不同而分离 密度大的物质在离心瓶底部 ，密度小的在上部 2.密度梯度离心法：,3.等密度离心法：,层析分离,一 吸附层析 1.原理：利用各物质在同种吸附剂中扩散速 度不同而分离 2.常用吸附剂：,二 分配层析,1.原理：利用吸附剂与载体的共同作用，各 物质扩散速度不同而分离，比吸附 层析效果好 2.三类：滤纸层析 ,三 离子交换层析,1.原理：利用离子交换剂上柱，以离子键与待分离物结合，再水洗掉杂质，洗脱剂洗脱待分离物，从而得到待分离物，离子键结合稳，效果好 2.几个重要的离子交换剂： 3.几个重要的洗脱剂： 离子交换剂： 阴离子交换剂：带正电的物质，可吸附阴离子 阳离子交换剂：带负电的物质，可吸附阳离子,层析基本操作过程,四 凝胶层析,1.原理：待分离液与凝胶溶液混合上柱，利 用大分子太大，不从凝胶网孔通过 ，而是从凝胶粒子间通过，受阻力 小，沉降快，而小分子小，可从凝 胶网孔通过，在凝胶中受阻力大， 沉降慢而分离分子大小差距大的物 质 2.几种常用凝胶：,五 亲和层析,1.原理：固定相上柱成母体，再用母体活化剂为母 体引入活泼基团，使母体以共价键与待分 离物结合，再水洗、洗脱得待分离物，母 体与待分离物结合稳，效果好 2.固定相： 3.母体活化剂： 母体：上柱的载体 配体：待分离物 固定相：同母体,亲和层析操作过程,固定相选择,固定相活化,层析过程,电泳分离,原理 电泳速率只与Q、r有关（电荷效应、分子筛效应），而Q与PH有关（PH趋近PI时Q最小，反之同理），r与M有关（M大则r大，反之同理） 支持物要求 均匀、阻力小, 电泳方法及原理,一 纸电泳 二 薄层电泳 三 薄膜电泳,四 凝胶电泳（比凝胶层析效果好）,1.凝胶的组成与制作 组成：单体+交联剂+催化剂 制作：三种成分混合溶解即可 2.单体、交联剂与凝胶网孔大小的关系 单体浓度网孔大小 交联剂浓度占5%网孔最小 3.连续凝胶电泳三连续：单体浓度、PH、缓冲液连续,不连续凝胶电泳,1.三个不连续：单体浓度、PH、缓冲液不连 续 2.三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩 效应 3.三层：样品胶层：最上层，与样品混合 浓缩胶层：样品大多因分子太大浓 缩于此 分离胶层：需分离出的样品通过浓缩层， 聚集于分离胶层 不连续凝胶电泳比连续凝胶电泳效果好,浓度梯度凝胶电泳,1.定义：上面单体浓度小，网孔大；往下单 体浓度依次增大，网孔依次变小， 增大了分子筛效应，比连续凝胶电 泳效果好 2.特点：分子筛效应大于电荷效应，为主要 效应 3.作用：不同质量数的物质聚于不同的胶层 ，M大的聚于上层，M小的聚于下层 可用于测/比较M,SDS-PAGE（,1.电泳速度只与网孔大小（分子筛效应）有 关原因 SDS与蛋白质结合，破坏三级结构二硫键，与蛋白质形成复合物，该复合物短轴均为18埃左右，长轴与M有关：M越大长轴越长，长度差距很大， M越大长轴越长，在凝胶中受到阻力越大，电泳速度越小,2.作用：测M,M与电泳速率有关： 可以通过测电泳速率得M,等电点聚焦电泳,1.原理：两性离子载体加入到电泳池中，两 电极通电后，正极到负极PH依次增 大，不同蛋白质PI不同，PH=PI时的 地方该蛋白质带电量为零，聚集于 此，可用于分离不同的蛋白质 2.两性离子载体：,萃取分离,一 有机萃取 1.原理：利用不同物质在有机溶剂中溶解度 不同而分离 2.作用：用于分离有机物与无机物,二 双水相萃取,1.双水相的制备方法 高聚物与高聚物：相互有排斥力，不成单相 高聚物与无机盐：有机物与无机物不成一相 2.原理：利用不同物质在双水相中溶解度不 同而分离 3.优点：可直接从细胞中提取酶，不用处理 细胞残片；可室温下操作，利于工 业化生产,三 超临界萃取,1.原理：超临界流体作萃取剂，利用不同物 质在超临界流体中溶解度不同而分 离 2.超临界流体：T、P超过临界值形成的流体 ，性质介于气相与液相之间 3.CO2作萃取剂原因：CO2临界点易达到， CO2 的超临界流体易制取 4. CO2作萃取剂优点：CO2无毒、不腐蚀、价格低 、可循环利用,四 反胶束萃取,1.原理：利用正胶束与反胶束转换分离出酶 2.定义 表面活性剂：极性基团与非极性基团组成的有机