《兽药残留检测技术》PPT课件.ppt

第六章 兽药残留检测技术,第一节 兽药残留,使用兽药的目的,防治食品动物疾病 促进生长 提高饲料利用率,兽药的使用情况,据19661974年统计,美国大约已有78%80%的食品动物,在其一生中或多或少服用过药物。,兽药的残留,兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。 兽药最高残留限量（MRL）：是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位g/kg, 以鲜重计）。 兽药残留主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的,另外,休药期过短, 是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。 休药期：是指自末次给药到动物允许屠宰或其动物性产品（乳、蛋等）获准上市的间隔时间。,兽药的危害,引起过敏、致畸、致突变及致癌等不良反应。,立法,为防止动物性食品中可能出现的药物残留损害人体健康,1984年在CAC的倡导下由联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合发起组织了食品中兽药残留立法委员会(CCRVDF)。 CCRVDF的主要宗旨是:为控制食品中的兽药残留,筛选并建立适用于全球的兽药及其他化学物残留的分析方法和取样方法;对兽药残留进行毒理学评价;按制订世界或地区性法规标准 (Codex Standart)的8个步骤,制定动物组织及产品中兽药最高残留限量(MRL)法规及休药期法规。,一、常见兽药,按用途分类,抗微生物药,抗寄生虫药,激素类药物,生长促进剂,抗菌药：磺胺药、呋喃类药、喹诺酮类,抗病毒药：干扰素,抗蠕虫药,抗原虫药,杀虫药,抗生素：青霉素、链霉素、氯霉素,1、抗微生物药,抗微生物药是指对病原微生物(细菌、真菌、支原体、病毒等)具抑制或杀灭作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺药及其他化学合成抗菌药。,根据化学结构可分类为:,(1)氨基糖苷类： 链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、安普霉素等。 (2) -内酰胺类： 青霉素、头孢菌素等。 (3)四环素类： 土霉素、金霉素、多西环素等。 (4)氯霉素类： 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。 (5)大环内酯类： 红霉素、吉他霉素、泰乐菌素等。 (6)林可胺类： 林可霉素、克林霉素。 (7)多肽类： 杆菌肽、黏菌素等。,(8)多烯类：两性霉素、制霉菌素等。 (9)磺胺类及抗菌增效剂： 磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺异唑、磺胺甲基异唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶等。 (10)硝基呋喃类：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。 (11)喹诺酮类：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、诺氟沙星、环丙沙星、奥比沙星、沙拉沙星、马波沙星等。,2、抗寄生虫药,抗寄生虫药是指能杀灭或驱除动物体内外寄生虫的药物。 畜禽寄生虫病的危害性极大,会给国民经济造成无法估量的巨大经济损失。 寄生虫病不仅引起大批畜禽死亡,而且严重影响动物生长率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜产品质量下降,数量减少。 某些人畜共患寄生虫病,还能直接威胁人类的健康和生命安全。,根据药物作用的特点，抗寄生虫药可分为:,(1)抗蠕虫药： 苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、有机磷酸酯类、四氢嘧啶类、水杨酰苯胺类、阿维菌素类、哌嗪衍生物等。 (2)抗原虫药： 聚醚类离子载体抗生素、三嗪类、二硝基类、氯羟吡啶。 (3)杀虫药： 有机磷化合物、拟除虫菊酯类化合物等。,3、激素与其他生长促进剂,(1)性激素 动物生产中使用的性激素,包括雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睾丸酮、丙酸睾酮、氯睾酮)。 (2)生长激素 是由动物脑垂体分泌的天然蛋白质激素,主要通过促进蛋白质合成和脂肪分解来促进动物生长,增加瘦肉率,提高饲料转化率。目前在畜牧业生产中使用的主要有牛生长激素(BST)和猪生长激素(PST)。,(3)甲状腺素,类甲状腺素及抗甲状腺素。 (4)人工合成的蛋白质同化激素 人工合成的蛋白质同化激素可促进动物脑下垂体生长激素的分泌。与抗生素一样,伴随着激素活性物质在畜禽生产中的使用种类和数量的不断增加,反对使用的呼声也越来越高。 (5)镇静剂和-肾上腺素阻断剂 为了控制被运输及等待屠宰的动物的紧张,有些畜牧业会非法使用镇静剂和肾上腺素阻滞剂。因为猪对于它们所处环境的突然变化特别敏感,随之产生的新陈代谢和紧张会影响肉的质量。,二、常见兽药残留的种类与危害 1. 抗生素类药物,多为天然发酵产物, 是临床应用最多的一类抗菌药物, 如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。,2. 磺胺类药物,主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺眯, 菌得清、新诺明等。 近年来, 磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象, 在所有兽药当中是最严重的。,3. 硝基呋喃类药物,主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。,4. 抗寄生虫类药物,主要用于驱虫或杀虫, 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。 而常用的苯并咪唑类抗寄生虫药物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。,5. 激素类药物,主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度, 使用于动物的激素有性激素和皮质激素。而以性激素(包括多种内源性性激素、人工合成的类似性激素的类固醇化合物、人工合成的具有性激素某些特性的非类固醇化合物) 最常用, 如孕酮、睾酮、雌二醇、甲基睾酮, 丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。,二、食物中兽药残留,(1)兽药残留 兽药残留是指动物产品的任何食用部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。,(2)兽药残留的来源,在食品动物体内或动物性食品中发现的违章残留,大都是由用药错误造成的,其原因主要有: 不正确地应用药物,如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示,这些因素有可能延长药物残留在体内的时间,从而需要增加休药的天数; 在休药期结束前屠宰动物; 屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检查; 以未经批准药物作为添加剂饲喂动物;,药物标签上的用法指示不当,造成违章残留物; 饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料; 接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的废水和排放的污水(如猪经常摄入这种污水); 任意以抗生素药渣喂猪或其他食品动物等滥用抗生素,是出现抗生素残留的主要原因。,(3)兽药残留的种类(形式),第一类是以游离或结合形式存在的原药及其主要代谢物(除高亲脂性化合物外),因代谢和排泄迅速,不会在动物体内蓄积。但这些物质可能具有毒性作用,而且被人摄入后在体内可生成高度活化的中间产物(亲电子基团、自由基等),因而对消费者具有潜在的危害性。 第二类是共价结合代谢物,因其从机体排出相对较慢,它们的存在对于靶动物有潜在的毒性作用,而对于消费者,由于结合残留在人体内不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只显示很低的毒性。,残留毒理学意义较大的兽药按其用途分类主要包括: 抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫类药、生长促进剂和杀虫剂等。 抗生素和抗菌素统称抗微生物药物,是最主要的兽药添加剂和兽药残留,约占药物添加剂的60%。,(4)影响食品动物组织中药物残留的因素,经内服或注射给药的动物,其组织中存在的药物及其代谢物或降解产物的残留。 组织中药物残留随药物种类、剂量、给药途径、药物及其代谢物特性的不同而异。 在有些情况下,饲料也会影响动物组织中的药物残留,但药物休药期的执行情况是影响组织残留的最重要因素。 屠宰后胴体加工过程也是影响药物残留检出率的因素之一。 烹调和贮藏温度亦影响残留药物在组织中的稳定性。,对于大多数抗微生物药来说,药物从动物体内消除属一级动力学,而大多数组织中药物残留抗微生物活性的丧失是一个零级动力学过程。这表示药物残留量越多,它们从食用组织中消除所需的时间就越长。 如果药物添加剂是亲脂性的,那么它们会蓄积在脂肪组织中,而且其消除速度明显比亲水性药物慢。 实际上,存在于家禽食用组织、牛肉、羊肉、乳和蛋中的药物残留的种类和发生率差异较大。这是动物屠宰前或其乳和蛋上市前停止用药时间长短的一种反映。,四、兽药残留的现状与法规,兽药残留主要是由于不合理使用药物治疗动物疾病和作为饲料药物添加剂而引起的。 1990年出口日本的1万吨肉鸡,由于检测出抗球虫药氯羟吡啶的残留量超标,要求我国政府销毁所有产品,给我国造成很大经济损失。 出口到德国的蜂蜜由于农药“杀虫脒”残留超标而被退货,接着欧共体、美国、日本也相继拒绝进口我国蜂蜜,使我国蜂蜜在世界市场上的销售发生严重因难。 1998年4月,从内地出口到香港的生猪,其内脏食后导致17人中毒。其原因是内脏中含有违禁药“盐酸克仑特罗”。 此外,我国出口的畜禽产品还多次出现安眠酮类、雌性激素、抗生素等药物残留超标而被取消出口的事件。,1995年、1996年,欧盟兽医委员会派员对我国进行了考察和评估,认为我国的兽医卫生状况达不到欧盟的要求,于是做出了从1996年8月1日起,禁止从我国进口禽肉的决定。 1997年、1998年欧盟又派员来华考察,结果仍达不到其要求。目前,我国肉、蛋、奶的出口形势仍相当严峻。 我国已开始重视动物性食品中的兽药残留问题,制订了各种兽药残留的法律和法规,修订了动物性食品中兽药残留最高限量标准,并开始建立了全国范围的兽药残留监控体系。,第六章 兽药残留检测技术,第二节 样品前处理,样品前处理是指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。 样品前处理的目的是消除基质干扰、保护仪器、提高检测方法的灵敏度、选择性、准确度、精密度。 不同样品前处理方法的选择，需要根据样品中危害残留物质的特点。 残留分析中的样品主要是各种食用组织(肌肉、脂肪、肝、肾、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)。 活体检测中一般采集血浆、尿液和粪便; 屠宰场主要采集某种药物的靶组织及其他高浓度的样本,如肝、肾、胆汁、注射部位的组织等。,一、生物样品的类型,兽药残留分析中,最常用的生物样品是组织样品,其次是奶、血液和尿液样品。 (1)动物组织 肌肉(除去可见的脂肪)中水分约占75%,蛋白质(肌浆蛋白、肌原蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖类1.2%,以及一些无机盐、维生素和酶类。 肌浆蛋白(肌红蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌动蛋白)溶于浓盐水,胶原蛋白和弹性蛋白(结缔组织)在上述溶剂中均不溶。,不同种类动物的食物构成和肌肉的成分,如家禽和牛的肌红蛋白和脂肪含量存在差异,这些变化会影响分析方法的回收率或干扰检测,因此一种动物组织的残留分析方法对其他动物组织样品不一定适用。 例如,用水提取鸡肉和牛肉组织中呋喃唑酮,回收率在75%以上;同样的方法提取猪肌肉样品,回收率仅为10%,改用25%乙腈提取时回收率明显提高,推测呋喃唑酮与猪肉中某种蛋白质结合较强。 肝或肾组织为代谢或排泄器官,残留物浓度高,消除缓慢,因此常被作为残留检测的靶组织。,(2)尿样,尿液的主要成分是水、尿素及盐类。它是一种良好的细菌培养基,因而需立即冷藏或防腐处理。 冷藏条件一般可置4 冰箱内。 若欲在室温下保存,应在收集尿样后,立即加入防腐剂。常用的防腐剂有甲苯、氯仿或改变尿液的酸碱性,以抑制细菌的繁殖。 加入的防腐剂是否干扰测定或与被测组分发生化学反应,应由实验验证,以便选取合适的防腐措施。,在所有体液样品中,尿样最容易获得,并且样品量多,内含药物(母体药物及代谢物)浓度高;正常尿液中仅含微量蛋白质,不需去蛋白处理。 尿中药物大多呈结合状态,主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在,因此无论直接测定或萃取分离之前,都必须将结合态的药物水解,使药物游离出来。 尿样pH变化范围大,分析前需调节到一致的pH值。,(3)血样,血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白,血液逐渐凝固,上层析出澄清的黄色液体称为血清(serum)。 分离血清时,可将凝结后的血液置离心机中离心,将上层血清转入另外容器中保存,得到的血清,一般可占全血量的40%左右。,若采血后立即将血液转入有抗凝剂(常用肝素)的容器中,并轻轻摇匀,则血液不再凝结,放置后血细胞会缓缓沉降,12h沉降完全,上层的黄色液体称为血浆(plasma)。 离心使上层血浆与下层血细胞充分分离,将血浆转移至另一容器内供分析。 血液通过抗凝获得的血浆量,一般比血清稍多,接近全血量的50%。,若抗凝血不离心,保持血浆和血细胞混合在一起,则称为全血(whole blood)。 全血样品可冷冻贮存或直接供分析。 全血样品放置或自贮存处取出解冻之后,可明显分为上、下两层,上层为血浆,下层为血细胞,但轻微摇动即可混匀。 血浆和血清的化学成分与组织液相近,测定血浆或血清中药物浓度,比全血更能反映作用部位药浓的变化,测定方法一般也可互相通用。因为从抗凝血制备血浆的速度较快,并且分离出的血浆量比血清多,所以应用血浆比较方便;若血浆中含有抗凝剂对测定有影响,则应使用血清样品。,通常药物在血浆中均与血浆蛋白(白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白)发生一定程度的结合,一些药物甚至蛋白结合率可达90%以上。因此在萃取之前,必须将结合态的药物游离出来。,(4)奶样,牛奶的含水量约87%,蛋白质(以酪蛋白为主)为3.3%,脂肪(甘油三酯)为3.7%,糖类(乳糖)为4.7%,以及一些无机盐、维生素和酶类(过氧化物酶、脂肪酶等)。 奶是一种复杂的非均相体系。 乳脂球的主要成分为乳脂,表面包以由酪蛋白、类脂、酶、无机盐和水分构成膜,使乳球能稳定地悬浮在奶中并保护内部的乳脂免遭脂肪酶的水解,当剧烈振荡时球膜被破坏,脂肪球即相互黏合析出。 奶中还含有大量由酪蛋白或脂蛋白构成的胶束体系,当酸化或加热时,胶束结构解体,蛋白质沉淀析出。,非解离性的或极性较低的药物易由血浆向奶中扩散,导致奶中残留。 与血浆样品类似,奶中的药物可与蛋白质结合。 因此在萃取之前,必须将结合态的药物游离出来。,(5)蛋,禽蛋包括蛋黄和蛋清。 蛋黄的含水量约50%、蛋白质16.5%、脂肪33%、糖类0.2%,以及一些无机盐、维生素和酶类(淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和过氧化氢酶) 蛋清含水量达88%,蛋白质10.5%和极少量的碳水化合物和脂肪。 与蛋清相比较,蛋黄基本上为疏水性环境,低极性药物的残留较多。,如果需要分别测定蛋黄和蛋清中的残留,最好将刚产出后的蛋分离蛋黄和蛋清,避免药物由蛋黄向蛋清扩散。 与尿液类似,蛋成分的pH变化范围大,分析前需调节pH值。,二、样品制备和贮存,样品的制备方法，依据法规要求的不同和食品本身特性的差异而不同。 有的要以全样计,有的以脂肪计。一般来说是取可食部分制备样品(除非有其他要求)。 如对于肉类有的国家法枧规定要以脂肪计算食品安全危害物的量,有的要求以全样来计算。,为保证取样的准确性、减少污染和便于保存,对组织样品宜分取一个完整解剖部分,如一个肝叶或一侧完整的肾,小动物应摘取完整的脏器,并立即密封。样品被绞碎或匀浆后进行缩分。 生物样品采样后除立即分析外,都需要在适当条件下保存,目的是避免被测组分发生分解或产生其他化学变化。,贮存,冷冻保存是最常用的方法,一般冷冻温度为-20,此时生物样品如血浆、尿液和组织样品均被冻凝,可以终止样品中酶的活性,又可以贮存样品。 在某些情况下若收集的样品来不及冷冻处理,可先将其置冰屑中,然后再行冷冻贮存,临用前再融化并放至室温后供测定。,对于一些易代谢的药物,如磺胺类、聚醚类、同化激素,它们的肝和肾脏样品不宜长期存放,理想的冷冻温度应为-40-80 。 为防止含酶样品中被测组分进一步代谢,采样后必须立即终止酶的活性。常采用的方法有:液氮中快速冷冻、微波照射、匀浆及沉淀、加入酶活性阻断剂(通常加入氟化钠)等。 某些生物样品中的药物易被空气氧化,如儿茶酚类中的阿朴吗啡,具有邻苯二酚结构,易被空气氧化产生醌类杂质,若收集的血浆样品不加抗氧剂直接在-15 冷藏,仅能稳定4周;但加入抗坏血酸后,则可稳定10周。,冷冻时,若使用玻璃容器贮存样品,需注意防止温度骤降使容器破裂,造成样品损失或污染。而塑料容器常含有高沸点的增塑剂,可能释放到样品中造成污染,而且还会吸留某些药物,引起分析误差。 某些药物特别是碱性药物还会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药物的定量回收,因此,必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。,三、样品均匀化,对于血浆、奶、尿液样品,可置涡旋混合器上混匀,以免造成测定误差。 对于肌肉、组织、粪便等半固体样品都存在均匀化这一问题。 其中肌肉和组织样品可置匀浆机中均质,粪便样品可加入少量甲醇或其他液体搅匀。 同时还应注意取样的代表性问题。,四、去蛋白处理,生物样品如肝脏、肾脏、血浆等含有大量的蛋白质,它们能结合药物,因此对于某些药物的测定,必须先将与蛋白结合的药物游离之后再作进一步处理。 为什么要除去蛋白？ 因为生物样品含有大量的蛋白质,蛋白质在测定过程中会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定。蛋白质还会污染仪器或恶化测定条件,如直接进样用液相色谱分析含蛋白质的体液样品时,蛋白质会沉积在色谱柱上,这不仅影响柱效,而且大大缩短色谱柱的使用寿命。 目前已有很多去蛋白方法可供使用,但使用各种方法之前应了解该方法是否会导致生物样品中的药物发生分解或影响药物的提取等。,注意方法选择,通常去蛋白过程是将蛋白质变性处理后,把与蛋白结合的药物解离出来,离心分离以除去蛋白。 通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂,使蛋白质脱水而沉淀(如有机溶剂、中性盐),有的是由于蛋白质形成不溶性盐而析出(如一些酸类:三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸),离心后取上清液用于分析。,1、有机溶剂沉淀,甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂,尤以甲醇和乙腈为最常用。 甲醇与蛋白形成絮状沉淀易于离心分离,得到澄清的上清液; 乙腈与蛋白形成致密沉淀,易离心除去,沉淀效率较甲醇高。 使用时应加入足量的沉淀剂,通常加入量为样品体积的1.52倍。,2、酸性沉淀,常用的酸性沉淀剂有三氯醋酸和高氯酸,其他还有钨酸、钼酸、磷钨酸、磷钼酸和苦味酸等。 酸性沉淀剂能同蛋白质的阳离子形成不溶盐而沉淀,必要条件是溶液的pH要低于蛋白的等电点。 加入沉淀剂之后立即形成白色沉淀(必要时可加热使沉淀完全),离心后可得到澄明的上清液。,三氯醋酸(常用10%溶液)沉淀蛋白的作用很强,因此最常使用,但应注意试剂中含有的杂质,将它们引入离心后的上清液中,可能会干扰药物的分析。 其次应注意,当上清液再用乙醚等有机溶剂萃取时,三氯醋酸则连同溶入其内的杂质会进入有机相,也可能干扰药物的分析。 采用高氯酸作为蛋白沉淀剂时,其优点是残留在上清液中的ClO4-可加入钾盐除去。,3、无机盐沉淀,一些无机盐如硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等,能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷,使蛋白质失去胶体性质而沉淀下来。 无机盐中以硫酸铵最常用。 常用的重金属盐类有汞盐、铜盐和锌盐等,它们能与蛋白质形成不溶盐而沉淀析出。 如可用HgCl2作为蛋白沉淀剂处理血浆样品,离心后用比色法测定上清液中的水杨酸浓度。 采用蛋白沉淀剂,只要加入足量,一般可除去98%以上的蛋白。蛋白沉淀后是否与之相结合的药物能游离释出,目前尚缺乏系统的研究资料,仅观察到少数现象。,4、透析法,透析法与超滤法也是除去样品中蛋白的方法。 透析法很费时,溶质透过膜的程度与被测物的性质、温度有关,膜需常常更新,很难自动化,因此透析法一般不用于常规分析,而用于药物在生物样品中蛋白结合率的研究。,5、超滤法,超滤法是另一种除去样品中蛋白和其他大分子的方法,也是一种薄膜分离技术。 与蛋白沉淀法相比,其优点是适用于小量样品,不稀释试样,也不改变试样的pH,尤其适于含对酸碱不稳定的化合物的样品,用于样品的浓缩、脱盐、不同分子尺寸的分离。 如果待测物易被某种酶分解,那么超滤除去该酶后就避免了待测物的分解。在残留分析中超滤法常用于牛奶、血液中游离药物浓度和药物-血浆蛋白结合率的测定。 超滤法的缺点是待测物可能被结合在滤膜上而影响回收率,而且一些能与大分子蛋白结合的药物也会随着蛋白质被除去而丢失。,五、冷冻干燥,冷冻干燥是贮存和预处理某些生物样品的有效方法,适合于处理量大的样品。 例如,一些样品中所含药物水溶性很强(不容易被有机溶剂萃取),可冻干后再进行液-固萃取。 冻干法也适用于一些含挥发性药物的样品以及对热不稳定的样品。 此外,还有一些生物样品中的药物需进行衍生化,若采用常规的液-液萃取,在一定温度下挥发去有机溶剂后再进行衍生化,则在加热过程中会导致药物分解或随溶剂一起挥发,因此也宜将这些样品经冻干处理后再行衍生化。,生物样品冻干时,可先将其置干冰-丙酮浴中、液氮中或其他低温条件下,半固体样品如粪便、组织等冷冻时间约110min。冷冻后水分在样品表面形成“冰壳”,增加了挥发面积,再将其放入冻干机内减压,冰则直接升华,和其他挥发性杂质一起被除去,使样品干燥。 冻干后的样品通常可直接加入有机溶剂萃取。 冻干时应注意某些挥发性强的药物可能挥发损失。,操作步骤,六、结合物水解,以结合状态存在的药物大多存在于尿中,但也存在于肝脏和血液中。常用的结合物水解的方法有: (1)酸水解 酸水解通常使用无机酸,如尿样中结合物水解可加入适量的盐酸液。 加入盐酸的浓度、酸化时间以及是否需要加热等,随药物而异,但最终应通过实验确定。 水解后的样品呈强酸性,必要时可用碱液调整pH后再进行萃取。,药物在体内经代谢反应之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等结合物,(2)酶水解,酶水解是专一性很强的水解结合物的方法。 通常使用的水解酶是-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专门水解药物的葡萄糖醛酸苷,后者水解药物的硫酸酯。 也可用两者的混合物,将生物样品中药物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同时水解。 尿液中通常存在以上两种结合物,因此混合酶水解法具有实用价值。,(3)溶剂解,某些药物或内源化合物的硫酸酯,可随加入的萃取溶剂,在萃取过程中发生分解,通常称为溶剂解。 溶剂解也是分解结合物较温和的一种方法。,七、样品提取和净化,1、液-液萃取 液-液萃取是经典的提取方法之一,它基于被测组分在不相溶的两种溶剂中的分配。 与其他方法相比,液-液萃取法仍是目前最常用的样品处理方法,其原因是: 通过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来,减少杂质对测定的干扰; 操作简单快速、经济实用; 可将萃取液蒸发,使组分富集; 可一次进行同类组分的萃取。,提取净化浓缩色谱分析,液-液萃取的溶剂选择,液-液萃取常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。 溶剂选择应注意以下几点: 溶剂的极性，根据相似相溶原理,极性组分易溶于极性溶剂,反之亦然,应根据被测组分的极性选择相似极性的溶剂。 实际萃取被测组分时,还常于萃取溶剂中加人第二种溶剂,以调整极性,使达到选择性萃取。,溶剂的沸点，萃取分离后的有机相通常需置温水浴中通压缩空气(或氮气)使挥发,将被测组分浓集,因此萃取溶剂的沸点就不应接近或高于水的沸点,否则挥发困难。 溶剂的毒性，使用对人体有害的溶剂萃取时,应在通风橱内进行。 在常用溶剂中,乙酸乙酯既安全又无毒,对不同极性的被测组分均有较高的萃取回收率,又易于挥发,萃取物中混入的内源杂质量少,是较理想的首选溶剂。,溶剂与水的互溶性 有的溶剂如乙醚,萃取后可混入大约1.2%的水分,因此伴随带入一些水溶性杂质。 乙醚萃取能力强,又易于挥发浓缩,为常用萃取溶剂,除去混入水分的方法是加入无水Na2SO4脱水,减少混入的水溶性杂质量。 萃取时于水相中加入有机相后,一般只萃取一次。特殊情况下(如杂质不易除去),则必须将第一次萃取分出的含药有机相,再用一定pH的水溶液反萃取,最后再从水相将药物萃回到有机相中。,萃取溶剂与水的比例,萃取过程中加入的有机溶剂并非越多越好,而应适量。 一般有机相与水相容积比以1:1或2:1为佳,据被测组分的性质及方法需要,有时也增加有机相的比例。 另外,萃取时若往水相中加入少量比重大的有机溶剂(如氯仿),而该溶剂对药物的溶解度又比较大,则可将药物从水相中浓集于小体积的有机相中,若萃取时使用的是尖底试管,则富含药物的有机相沉积于管尖部位,可直接取样分析,或将其分离出来。,离子对试剂,一些酸性或碱性较强的有机药物在体液中呈离解状态,成为亲水性极强的带电荷离子,即使控制pH也不能抑制它们的电离,不能用有机溶剂将其自体液中提取出来。 对于上述呈离解状态的药物,可加入离子对试剂,使它们形成具有一定脂溶性的离子对络合物,用有机溶剂将其从水相中萃取出来。 阳离子药物配对的离子对试剂则为阴离子,其中以烷基磺酸盐类(RSO3H)为最常用。,阴离子药物配对的离子对试剂主要为烷基季铵类化合物,可用通式R4N+ X-表示,X-可为酸根或氢氧基,R为烷基。 烷基碳链长度常用C4C12,甚至可选用C20,碳链越长，则生成的离子对络合物脂溶性越高。 常用的烷基季铵中有四丁基铵、四戊基铵等,商品试剂常用其盐,如磷酸四丁基铵、硫酸氢四丁基铵,或为其氢氧化碱,如氢氧化四丁基铵。,注意事项：,液-液提取有时会发生乳化现象以及被测组分损失。为了防止乳化,可应用较大体积的有机溶剂,避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力而破乳,若已发生严重的乳化现象,可将试管置于冰箱中冷冻破乳。 萃取过程中所用的玻璃容器壁对某些药物的吸附是不可忽略的,特别是当药物浓度较低时更是如此。除对萃取所用的器具进行硅烷化处理以外,还常在萃取剂中加入异戊醇。异戊醇能减少玻璃壁的吸附,还可减少萃取过程中乳化的形成。也可以加入二乙胺,二乙胺能显著减少吸附作用,提高萃取回收率。,2、固相萃取(SPE),固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)是近十几年迅速发展起来的一种样品预处理技术,它是以液相色谱分离机制为基础建立起来的分离和纯化方法。 固相分离有两种实现样品纯化的途径。一种是保留杂质,待测组分不被保留而自然流出或者被洗脱;更为常用的一种途径是先使待测物完全保留在柱上,使干扰杂质随样品溶剂或洗涤液洗出,然后以小体积溶剂洗脱待测物。,优点：,与经典的液-液萃取法相比,固相萃取的优点有: 快速,一般l2min即可完成; 回收率高,通常超过90%; 精密度比较好; 样品用量少,有一定的选择性,无乳化现象等。,SPE柱,SPE柱可以是一个玻璃(或塑料)小柱,装入适当的填料(固相提取剂),自制的固相萃取柱填充疏松,溶剂能自然流出。 现在已经有许多不同形式的商品化固相萃取柱,大多数商品化柱都是聚丙烯管型柱,底部压缩装入100500mg的填料。 使用时将液体样品从柱上口加入,样液通过固相萃取柱下端流出,液体样品通过柱子时必须施加外力,可在柱下端出口处减压,或于柱上口加压,使样液通过柱床,柱下端流出液可用另一支试管收集。,固相萃取装置和操作过程,SPE采用的固定相与液相色谱常用的固定相类型相同,常用的固定相有活性炭、硅胶、氧化铝等吸附剂、高分子大孔树脂、离子交换树脂和键合硅胶等。 键合硅胶固相提取的一般操作步骤如下: 以适当强溶剂湿润固相萃取柱使其溶剂化; 以弱溶剂通常是水或缓冲溶液洗涤固定相,使其达到良好的分离状态; 将溶于弱溶剂常是缓冲溶液中的样品加到固相提取柱上; 以强度适当的弱溶剂,如含有少量甲醇的水或缓冲溶液洗涤、除去基质或干扰组分; 用强度较高的溶剂洗脱待测组分,收集洗脱液,直接或适当浓缩后进行色谱分析。,选择SPE柱,选择SPE固定相时,主要依据两个因素:需要提取的溶质和样品溶剂。 （1）溶质的极性： 分析物的极性与固定相极性非常相似时得到分析物的最佳保留。 两者极性越相似保留越好以要尽量选择极性相似的固定相。 例如萃取碳氢化合物（非极性）要采用反相柱（非极性）。 当分析物极性适中时、反相固定相都可使用。,（2）溶剂强度,固定相选择还受样品溶剂强度的制约。 样品溶剂强度相对该固定相应该较弱溶剂会增强分析物在吸附剂上的保留。如果溶剂太强得不到保留或保留很弱。 举例：样品的溶剂是正己烷时，反相柱就不合适，因为正己烷是强溶剂，分析物不会有保留；当样品溶剂是水时，可以用反相柱，因为水是弱溶剂，不影响分析物的保留。,（3）其他因素,其他还应该考虑以下几点： 分析物在极性或非极性溶剂中的溶解度； 分析物有无可能离子化，从而决定可否用离子交换固定相； 分析物有无可能与固定相形成共价键； 不要的组分与分析物在固定相结合点上的竞争程度。,3、基质固相分散技术（MSPD）,基本操作： 将样品 (固态或液态)直接与适量反相键合硅胶一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒的表面，制成半固态装柱，然后后采用类似于SPE的操作进行洗脱。 所用的填充料一般为C18或C8，样品和填充料的比例通常为1:4。,MSPD是一种在SPE的基础上改进后的样品处理方法，相对于SPE法，它的优点在于： 依靠机械剪切力、C18键合相的去垢效应和巨大的表面积，使样品结构破碎并且在填料表面均匀分散，浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程，避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失，而且固定相处理样品的比容量大，提取净化的效率较高。 MSPD处理样品耗时短、节省溶剂、样品用量少，该方法已被用于近40种的兽药残留分析。,4、柱切换技术,柱切换技术是色谱分析中处理复杂样品的方法之一。 利用切换阀改变不同的色谱系统，达到在线样品净化、组分富集等目的。此法常用一种长35cm，填以粒径2540m填料（类型取决于待测物的保留能力）的预柱，通过切换阀与分析柱连接。 进样后流动相携带样品进入色谱柱，被测组分保留于预柱上，而杂质则随流动相作为废液 流出。然后按预先设定的程序改变切换阀的流路，将流动相引入预柱中，流动相洗脱出的被测组分随即进入分析柱，经分离后进入检测器检测。,柱切换法的优点,操作简单，全自动化，含蛋白样品可直接进样或简单地沉淀蛋白离心后即可进样； 分析结果精密度高，一般无需内标，进样体积一般为0.21.0mL（血浆、血清因黏度较大，需稀释后进样），在线处理全过程由计算机程序控制，每个样品在同一预柱的相同条件下处理，分析结果的RSD一般小于5%。 适于不稳定样品，如易光解、热不稳定样品的分析，全部过程在封闭状态下进行，避免了分离、浓缩等操作； 富集作用，提高了检测灵敏度，尤其是极性较大的组分，无法用液-液萃取时，柱切换技术特别奏效。,5、超临界流体萃取（SFE）,超临界流体萃取是一种较新的样品预处理技术，以超临界流体（常用二氧化碳）作为提取溶剂。 超临界流体的性质如密度、粘度和扩散性等处于气体和液体之间，而且与温度、压力和流体组成有关。 密度越高,其性质越接近液体;密度越低,其性质越接近气体。 超临界流体既能溶解各种气体不溶解的物质,又有气体黏度小、渗透力强等优点,可以快速、高效地将被测物从样品中萃取出来。,超临界二氧化碳萃取流程图,二氧化碳液体由高压泵输入处于恒温的预热管中转化为超临界流体并进入样品管进行萃取。萃取物随流体通过限流管降温后进入有少量填料的吸收管内,最后被收集瓶收集。 超临界流体萃取过程大致可分为下面三步: 待测物质从样品基质中释放出来并扩散、溶解进入超临界流体中； 待测物质从萃取器转移至收集系统； 降低超临界流体的压力，有效地收集被萃取的待测物。,对于极性较大或者离子型化合物,可选择氨等萃取剂。 压力的变化可以改变超临界流体对物质的溶解度,因此采用程序升压就可以把溶解度从大到小的物质先后从样品中分离出来。 根据被萃取物溶解度的大小,可以采用动态、循环和静态不同的操作方法。 动态法是让流体一次通过样品,这种方法适合溶解度较大的样品。 静态法是将样品在流体中浸泡一段时间后,再使被萃取物从样品中分离出来。 循环法是让一定量的流体循环多次通过样品,循环法既可以萃取难溶物质同时又比静态法萃取速度快。,6、固相微萃取（SPME）,固相微萃取的原理与SPE不同，是建立在待测物在固定相和水相之间达成平衡分配的基础上。其样品的前处理和操作也有很大的差异。 固相微萃取采用熔融石英光导纤维为固相吸附剂,将其浸泡在样品溶液中时,样品中的有机物被吸附在光导纤维的表面。吸附平衡后通过加热可使被吸附的物质解吸,被解吸的物质可随着载气流入气相色谱仪进行分离测定。,光导纤维是装在类似于微量注射器的固相微萃取的针头内,针头起着导向和保护光导纤维不被折断的作用。 萃取时将针头浸入被萃取液中,吸附平衡后再插入气相色谱的进样口。光导纤维的吸附量和原始液的浓度有一定的关系。因此固相微萃取是一种简便、快速、无溶剂的前处理技术。,固相微萃取法被广泛地应用于样品的分析中。包括固态(如沉积物、土壤等)、液态(地下水、地表水、饮用水、废水)及气态(空气及废气)中的卤代烃(包括卤代芳烃)、有机氨农药、多环芳烃、胺类化合物以及石油类等。 已有大量的应用文献报道。,7、免疫亲和色谱IAC,免疫亲和色谱(Immno-afinity chromatograplly, IAC)是以抗原抗体的特异性、可逆性免疫结合反应为原理的色谱技术,其基本过程为将抗体与惰性基质(如珠状琼脂糖、键合相硅胶)偶联制成固定相,装柱。 当含有待测组分的样品通过IAC柱时,固定抗体选择性地结合待测物,其他不被识别的样本杂质则不受阻碍地流出IAC柱,经洗涤除去杂质后将抗原-抗体复合物解离,待测物被洗脱,样品得到净化。 IAC的最显著优点在于对待测物的高效、高选择性保留能力,特别适用于复杂样品痕量组分的净化与富集。,第六章 兽药残留检测技术,第三节 样品衍生化技术,一、衍生化,衍生化是将样品中的待测组分制成衍生物,使其更适合于特定的分析方法。 衍生化在色谱分析中的作用归纳起来主要有以下几点: 提高检测灵敏度; 改变化合物的色谱性能,改善分离效果; 适合进一步做化合物的结构鉴定; 扩大色谱分析的应用范围。,(1)柱前衍生化,柱前衍生化是在色谱分离前,预先将样品制成适当的衍生物,然后进行分离和检测。 优点：衍生化试剂、反应时间和反应条件的选择都不受色谱条件的限制,衍生化后的样品能用各种预处理方法进行纯化和浓缩,也不需要附加特殊的仪器设备。 缺点：操作比较繁杂费时,容易引起误差,影响测定的准确度。 当衍生化试剂的分子量相对大时,其引入还可能减小组分间由于分子大小差别而产生的色谱保留行为的差别。,(2)柱后衍生化,柱后衍生化是样品经色谱分离后,使衍生化试剂与色谱流出组分在系统内进行反应,然后检测衍生物。 优点：操作简便、重复性好,色谱分离相衍生化连续自动进行,而且衍生化不影响组分的色谱分离。 缺点：需要附加输液泵、混合室和反应器等装置,由于柱出口至检测器间有较长的流程,可能发生色谱峰展宽。,实现柱后衍生化必须满足下列条件:,衍生化试剂足够稳定,对检测器的响应可以忽略,不产生干扰; 衍生化试剂溶液与色谱流动相能互相混溶,混合后不产生沉淀或分层,而且色谱流动相适宜作衍生化反应的介质; 衍生化试剂与色谱柱流出液的速度要匹配,混合迅速且均匀,以免产生噪声; 衍生化反应必须迅速和重现性好,反应器设计要合理,以尽可能减少峰展宽。,二、HPLC柱后衍生化,(1)柱后衍生化装置 柱后衍生化使色谱柱至检测器之间增加了混合器与反应器及多个连接部件,这些都将产生柱外效应,导致峰展宽。 连接部件产生的峰展宽决定于所用的材料、长度和内径,需要仔细选择。 高效率混合器 管式反应器：螺旋型、编织型,(2)固相衍生化,将固体微粒(硅胶或高分子微球)填充于内径56mm、长度2530cm的柱子内就是一个固相衍生化器。 固体微粒的表面通常经过处理连接有反应基团,叫作固相反应剂。 固相反应剂的种类很多,包括氧化型、还原型、基团转移型和催化剂型,可适应各种衍生化反应的需要。 样品通过时与反应剂发生衍生化反应,这是一种非均匀体系的反应。 大分子只能与担体表面的试剂作用,而小分子可以进入担体的所有反应部位,因此当有大分子干扰物存在时,只有痕量大分子发生衍生化,不干扰小分子待测物的检测。,柱后衍生化的一种形式,特点：,反应试剂的局部浓度很高,有利于反应进行完全; 过量衍生化试剂不会进入检测器,降低了检测本底,提高灵敏度; 反应速度取决于溶液接触的表面积(填料粒度),由于填料粒度小,因而反应速度快; 反应受色谱流动相的影响小; 不需额外的混合器、管线、接头等,减少了峰展宽因素。,(3)固定化酶衍生化,最早期把一种酶连接于螺旋管的内壁就是最早最简单的酶反应器。 现代的固定化酶反应器都是将酶固定在担体上,这实际上是一种特殊的催化剂型固相衍生化试剂。 优点：酶反应的专一性很强,因此方法的选择性很高。固定化后,酶的稳定性大大提高,而且可以重复使用。 缺点：固定化酶的工作稳定性受担体、温度、溶剂、pH和酶抑制剂的影响。 如果溶剂及其pH不合适,就可能使酶迅速失去活性。HPLC流动相中的固体微粒、细菌、某些金属离子等都有可能使酶失去活性,应当除去。,固相衍生化的一种特殊型式,(4)光化学衍生化,光化学衍生化是使色谱柱流出的组分在光照射下发生某种反应,所产生的衍生物再被检测器检测。 只需在色谱柱与检测器间 安装一个光源和一段反应管。 光源：高强度紫外灯、激光 反应管可以缠绕在光源上, 或者编织成套直接套在光电管上。 检测器：紫外-可见检测器、荧光检测器或电化学检测器。,柱后衍生化的一种形式,成功的光化学衍生化必须符合下列条件:,待测组分能够吸收适宜波长的光,可以想象它们应该是芳香或共轭不饱和化合物; 色谱洗脱液对上述波长的光应该透明; 光源在上述波长处有足够的光通量(光强); 光反应足够迅速; 反应产物足够稳定,而且能用上述检测器之一进行检测。,光化学衍生化的主要特点：,价格低廉,光可能是最便宜的衍生化试剂; 设备简单,不需额外仪器(泵等),也不需要任何衍生化试剂,减少了污染; 在恒流条件下,有恒定和重现的动力学参数。 因此,使反应不完全甚至未达平衡,能进行定量测定。,三、GC柱后衍生化,(1)柱后裂解器 裂解器是一个石英或金线圈或者是一个氧化还原器,在反应器后检测分析各色谱组分裂解产生的C、H、O和N元素。柱后裂解能对色谱峰进行化学结构鉴定,这一点与MS的作用相似。 (2)柱后浓集器 柱后浓集器主要用于GC-MS,但是也能改善其他检测器的信噪比。 浓集器主要有四类,即喷射分离器、烧结玻璃分离器、多孔膜和高聚膜。,(3)柱后反应器,有一种含有镍-硅藻土催化剂的微型反应器,加热至425 时,能允许氢气自由通过,而其他组分则裂解成甲烷和水。除去水后,以热导池检测甲烷。 氢反应器能使色谱峰中含有卤素或氮的组分还原成氢卤酸和氨,然后进行库仑检测或电导检测。 另一种氢反应器将含氮化合物转变成氨后,再流进一个装置与邻苯二甲醛(OPA)和巯基乙醇反应,并进行荧光检测。,四、用于液相色谱的化学衍生化,须满足的要求： 反应能迅速、定量地进行,而且对反应条件要求不苛刻; 反应的选择性高,最好只与待分析组分发生反应; 过量的衍生化试剂或反应的副产物不干扰样品的分离和检测; 衍生化试剂方便易得。,选择衍生化试剂要考虑的因素,首先要考虑的是待测化合物的结构和化学性质,根据这一点可以找出可能合适的衍生化反应及相应的分离和检测方法。 其次还要考虑样品基质和可能存在的干扰物质的影响,有时可能要进行适当的分离或净