《分子生物学讲座》PPT课件.ppt

1、原核生物启动子的基本结构,二、启动子（promoter）,原核生物启动子,2、真核生物启动子的基本结构,真核生物的启动子有其特殊性，真核生物有多种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。以RNA聚合酶的启动子结构为例，人们比较了上百个真核生物RNA聚合酶的启动子核苷酸序列的结构，发现在-25区有TATA框，又称为Hogness框或Goldberg-Hogness框。其一致序列为T28A97A93A85A63T37A83A50T37，基本上都由A，T碱基所组成，又叫 TATA框。,TATA框决定了转录的起始部位，即RNA聚合酶要和它结合才可以开始转录。CAAT框则决定了转录的起始频率。 由于真核生物突变体的诱导和鉴定非常困难，所以，真核生物启动子的研究远比原核生物困难。 除启动子外，真核生物转录起始点上游处还有一个称为增强子的序列，它能极大地增强启动子的活性，它的位置往往不固定，可存在于启动子上游或下游。,在原核生物中，当RNA聚合酶的亚基发现其识别位点（ -35区）时，全酶就与启动子的-35区序列结合形成一个封闭（指DNA为双链状态）的启动子复合物。由于全酶分子较大（大约可以覆盖70bp的长度），其另一端可到达-10区。这时，整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合，在此处发生局部DNA的解链（一般在12-17bp左右），形成全酶和启动子的开放性（DNA为单链状态）复合物。,三、转录的开始和延伸,在复合物中起始位点和延长位点被相应的核苷酸充满，在RNA聚合酶亚基催化下形成RNA的第一个磷酸二酯键。RNA合成的第一个核苷酸总有GTP或ATP，以GTP常见。 此时因子就完成了它这一次起始的使命，从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的因子与另一个核心酶结合成全酶，可以反复利用。,真核生物的转录起始机制非常复杂，还不是很清楚。因为有多种转录酶，每一种都有它的特异性。但是，可以知道的是，有许多蛋白质转录因子要参与起始和延伸。（参考p408-410） 转录的速度：30-50bp/秒，但不是恒定的，会有变化。,四、转录的终止（Termination),转录是在DNA模板某一位置上停止的，人们比较了若干原核生物RNA转录终止位点附近的DNA序列，发现DNA模板上的转录终止信号有两种情况: 一类是不依赖于蛋白质因子而实现的终止作用， 一类是依赖蛋白质辅因子才能实现终止作用，这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称因子。 两类终止信号有共同的序列特征，在转录终止之前有一段回文结构。,不依赖因子的终止序列中富含GC碱基对，其下游6-8个A。 依赖因子的终止序列中GC碱基对含量较少，其下游序列也没有固定的特征，转录生成的RNA可形成二级结构即柄一噜噗结构，又称发夹结构。这样的二级结构可能与RNA聚合酶某种特定的空间结构相嵌合，阻碍了RNA聚合酶进一步发挥作用 。 除DNA模板本身的终止信号外，在噬菌体中，发现一些蛋白质有协助RNA聚合酶跨越终止部位的作用，叫抗转录终止蛋白。,终止序列的特征：,真核生物由于RNA转录后很快就进行了加工，因此很难确定原初转录物的3末端。病毒SV40的终止位点经过研究发现，很像大肠杆菌的不依赖因子的终止子，转录后的RNA可形成一个发夹结构，3末端带有一连串的U。爪蟾5sRNA的3末端有4个U，它们前后的序列为富含GC的序列，这是所有真核生物RNA聚合酶转录的终止信号。这种序列特征高度保守，从酵母到人都很相似，任何改变这种序列特征的突变都将导致转录终止位置的改变。,第二节 RNA转录后的加工与修饰,提示： 原核或真核生物的rRNAs和tRNAs都是以初级转录本(transcript)形式被合成的，然后加工成为成熟的RNA分子。 绝大多数原核生物的mRNA却不需加工，仍为初级转录本的形式。 真核生物产生的mRNA要经过复杂的加工才能成为成熟的RNA。加工过程大致分为四种。,一、mRNA的转录后加工,1、原核生物 转录生成的一条mRNA可以包含几个基因，有共同的启动子和共同终止信号，编码几种不同的蛋白质。例如乳糖操纵子上的Z、Y及A基因，转录生成的mRNA可翻译生成三种酶，即半乳糖苷酶，透过酶和乙酰基转移酶。原核生物中没有核膜，所以转录与翻译是连续进行的，往往转录还未完成，翻译已经开始了，因此原核生物中转录生成的mRNA没有特殊的转录后加工修饰过程。,2、真核生物 真核生物转录一个mRNA分子，只编码一种蛋白质分子。 真核生物mRNA的加工修饰，主要包括对5端和3端的修饰以及对中间部分进行剪接。 （1）加帽：转录开始后，mRNA就会通过鸟苷酸转移酶在5端催化产生5-5之间的磷酸二酯键。再通过鸟嘌呤甲基转移酶在G7位甲基化，这种帽子叫“0型帽子”。用符号表示：m7GpppX 。在酵母当中，这种类型的帽子占据绝对优势。,如果在第一个核苷酸的2-O位上再发生甲基化，则形成了“2型帽子”，符号表示为：m7GpppXm 。这种形式是除了单细胞真核生物以外的其他大多数真核生物帽子的主要形式。 在某些真核生物中，还存在着第二个核苷酸（可以是四种中的任何一个）的2-O位上再发生甲基化的情况，这样就产生了“3型帽子”。用符号表示为：m7GpppXmpYm，这种类型比较少，只有戴帽子mRNA的10-15%左右。 不同生物的帽子结构不同，进化程度高，结构越复杂。,三种不同的5端“帽子”,三种不同的5端“帽子”,（2）5帽子的作用：主要包括： 它是mRNA 做为翻译起始的必要的结构，对核糖体对mRNA的识别提供了信号。“0型帽子”是核糖体识别mRNA的必需结构。体外翻译试验表明，没有帽子的mRNA，不能进行有效的翻译。 这种帽子结构还可能增加mRNA的稳定性，保护mRNA 免遭5外切核酸酶的攻击。 帮助其从核内运输到细胞质里。 大多数的RNA病毒都可以在他们的基因组和mRNA上加帽，有些自己不能加帽的可以从宿主细胞的mRNA中偷帽子，叫“抢帽”（cap-snatching）。,（3）多聚腺苷酸尾巴 大多数（2/3）的真核mRNA 都有3端的多聚（A)尾巴，多聚（A)尾巴大约为200bp。 多聚（A)尾巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。此反应受poly（A）聚合酶（又叫RNA末端腺苷酸转移酶）催化，并加上约200个A残基。 过程：转录产物的3末端由一个特异酶切除一端，该酶可以识别这个酶切位点上游13-20bp附近的特殊序列AAUAAA，此序列高度保守，又叫“加尾信号”。如果U发出突变，则切除和加尾效率明显降低。,（4） polyA尾巴功能： 关于polyA尾巴的功能问题尽管经过极其广泛的探索，但还不完全清楚。有人推测polyA可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关，但是相当数量的没有polyA尾巴的mRNA如组蛋白mRNA，也照样通过核膜进入细胞质。还有人认为这种结构对真核mRNA的翻译效率具有某种作用，并能稳定mRNA结构，保持一定的生物半衰期。有人也认为和小核RNA（snRNA）有关。snRNA不是单独起作用 。,二、rRNA的转录后加工,原核生物 原核生物大肠杆菌有三种rRNA，即5S，16S和23S，分别有120bp，1541bp和2904bp。其中5S的核苷酸中有一段保守序列，可以和tRNA的TC环结合，是二者相互识别的位点。 原核生物rRNA转录后加工，包括以下几方面：,大肠杆菌中有7种操纵子，这些操纵子中排列着rRNA和tRNA基因，其中rRNA 首先合成一个30S的前体； 前体被大肠杆菌的RNase，RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子； rRNA分子在修饰酶催化下进行碱基修饰； rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基 。,真核生物 真核生物rRNA前体比原核生物大，包括四种rRNA