PRRSV经典株与Nsp2变异株RTPCR鉴别诊断方法的标准操作规程.doc

PRRSV经典株与Nsp2变异株RT-PCR鉴别诊断方法的标准操作规程（检验SOP）1适用范围本标准规定了猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）经典毒株与Nsp2基因缺失株的特异性逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）区分技术。本标准适用于疑似感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的猪的组织、血液及其他病料样品。2. 试剂2.1 天根公司TIANamp Virus RNA Kit 病毒RNA提取试剂盒，目录号：DP315-R2.2 赛百盛公司 goldview2.3 天根公司Quant One Step RT-PCR Kit，目录号：KR113公司2.4 琼脂糖2.5 分析纯酒精（99.7%）2.6 6DNA电泳Loading Buffer3实验室条件3.1仪器：PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外仪、微量移液器、水浴箱等。3.2从事PCR工作的实验室尽可能分区，根据条件划分出DNA提取区、基因扩增区、电泳区。特别注意电泳后的琼脂糖凝胶要及时处理，避免对实验室造成污染。4. 试剂的准备4.1 扩增PRRSV的引物：PRRSV P1、PRRSV P2、PRRSV LOW。4.2 1.5%琼脂糖凝胶加入0.1% goldview4.3 1TAE缓冲液4.4 goldview4.5灭菌超纯水4.6 DNA分子量标准（Marker DL1000） 5. 操作步骤5.1 样品处理处理材料：a. 材料为发病猪只血液、血清或淋巴液可直接吸取140L。b. 材料为细胞上清液，可直接使用140L新鲜上清混匀。c. 材料为贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，反复冻融三次，然后3000r/min离心5min，取上清液140L。d材料为病猪肺脏、淋巴结、扁桃体等病料样品时，需要先用生理盐水或PBS进行研磨，收集研磨物后反复冻融3次，12 000r/min离心10min，取上清140L。5.2 用移液器将560L Carrier RNA工作液（为裂解液RL与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法如附录配液表配制）加入一个干净的1.5mL离心管中。注意：如果样本体积大于140L，可等比例增加工作溶液和无水乙醇的用量。5.3 向离心管中加入140L检测样品（样品需平衡至室温），涡旋振荡15秒混匀。注意：为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA 工作液需要彻底混匀。5.4 在室温（15-25）孵育10分钟。5.5 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。5.6 加入560L无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒。注意：如果周围环境高于25, 乙醇需要在冰上预冷后再加入。5.7 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。5.8 仔细将离心管中的630L液体转移至RNase-free吸附柱CR2（吸附柱放在2mL收集管中），盖上管盖，6000g（8000rpm）离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。注意：如果吸附柱上的液体未能全部离心至收集管中，请加大转速，延长离心时间至液体完全转移到收集管中，如为组织苗，在过柱前请离心后将上清液过柱。5.9 重复此步骤7。5.10 小心打开吸附柱盖子，加入500L溶液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，6000g（8000rpm）离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。5.11 小心打开吸附柱盖子，加入500L溶液RW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，6000g （8000rpm）离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。5.12 将吸附柱放回收集管中，13,400g （12,000rpm）离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液。注意：乙醇的残留可能会对后续实验造成影响。5.13 可选步骤：将吸附柱放回2mL收集管中，打开吸附柱盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干。5.14 将吸附柱放入一个RNase-free 超净离心管（1.5mL）中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入60L RNase-free ddH2O，盖上盖子，室温放置5分钟。6000g （8000rpm）离心1分钟。5.15 可选步骤：将上一步骤的洗脱液再次加入膜中央，并6000g （8000rpm）离心1分钟，以增强RNA洗脱效果。注意：确保洗脱液（RNase-free ddH2O）在室温平衡后再使用。如果加入洗脱液的体积很小（小于50L），为了将膜上的RNA 充分洗脱下来，应注意将洗脱液加到膜的中央位置。洗脱体积可以根据后续的实验要求灵活处理，洗脱液（RNase-free ddH2O）加到吸附柱后，离心前在室温放置5分钟，有助于提高RNA 的产量。5.16 将提取的RNA样品按照下条件进行RT-PCR，剩余部分请及时放入-80保存（所有配置工作均在冰上进行）。检测设阴、阳性对照。配置如下体系：(25L体系)Rnase-free ddH2O 8.75L10RT-PCR buffer 2.5LdNTP Mixture 1.0L5RT-PCR enhancer 5.0LHotmaster Taq polymerase 1.25LQuant Rtase 0.25LRnase 0.25L扩增引物(P1P2LOW) 各1.0LRNA模板 3.0LPRRSV检测反应条件：(1) 反转录反应 30min 50(2) PCR预变性 4min 94(3) 变性 40s 94(4) 退火 40s 55 35 Cycles(5) 延伸 40s 65 (6) 延伸 10min 65(7) 保温 165.17 电泳5.17.1 制备1.5%琼脂糖凝胶板。 5.17.2 取5L PCR产物与1L的上样缓冲液（10loading buffer）混匀后加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。5.17.3 加入分子量标准。5.17.4 盖好电泳仪，插好电极，90V电压电泳，1h。5.17.5 在紫外仪观测下用数码相机照相并进行照片存档。5.17.6 用分子量标准比较判断PCR片段大小。6. 结果判定每次样品应当设置标准阳性对照（经典毒株与Nsp2缺失毒株）及空白对照，若待检样品扩增出与经典毒株标准阳性对照大小相同的特异性条带且空白对照无条带，即可判为经典毒株感染；若检测样品扩增出Nsp2基因缺失株标准阳性对照大小相同的特异性条带且空白对照无条带，即可判断为Nsp2基因缺失毒株感染；未扩增出与标准阳性对照大小相近的特异性条带，则判为阴性；若空白对照扩增出与标准阳性对照相似的条带，则该次实验判为失败，应当重新进行一次RT-PCR检测。图1 PRRSV的检测结果M: Marker DL1000；+1为CH-1a株阳性对照，+2为经典株阳性对照、+3为变异株阳性对照；1、2、3、4为样品编号。注：蓝耳变异株扩增目的片段为180bp，蓝耳经典株扩增目的片段为250bp。附录:TAE电泳缓冲液(50)1 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0)二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g灭菌双蒸水 80mL氢氧化钠 调pH至8.0灭菌双蒸水 加至100mL2 TAE电泳缓冲液(50)配制 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242g 冰乙酸 57.1mL 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0) 100mL 灭菌双蒸水 加至1 000mL 3 1%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.5g TAE电泳缓冲液(1) 100mL 微波炉中完全融化，加goldview5L 混匀。4. Carrier RNA 工作液的配制样品个数RV(mL) Carrier RNA水溶液(L)样品个数RV(mL) Carrier RNA水溶液1 0.56 5.613 7.28 72.82 1.12 11.214 7.84 78.4