《微生物分类鉴定》PPT课件.ppt

本章重点掌握 1微生物的分类单位。 2微生物学名的书写及意义。 3. 菌种鉴定的方法。 了解 1微生物的分类系统。 2. 菌种鉴定的条件。,第十章 微生物的分类鉴定,微生物的分类（classification）: 按照它们进化的亲缘关系，根据形态、生理性状的差异，把它们有次序地、分门别类地，排列成一个系统，这就是微生物的分类。 微生物的鉴定（identification）: 对某个未知微生物，根据培养特征，与已知的菌种特征进行对比分析，按照“对号入座”的原则，设法从分类检索表中查找出具体的位置和“名字”。如是新种，则给以新的名称，补充到检索表中去。,学习和掌握微生物的分类鉴定知识，对生产实践和科学实验有着重要的意义： 1、能够在较短时间内认识熟悉微生物界全貌，以利进一步开发和利用这一丰富的微生物资源。 2、掌握了分类方面的知识，可以减少菌种筛选工作的盲目性，提高工作效率。 3、有利于各国微生物学工作者之间的交流。 4、有利于对未知菌种的鉴定。 由于微生物形体微小，发育过程简单，种类繁多，缺乏古生物资料，很多微生物的亲缘关系尚未搞清楚。 到目前为止，微生物还没有一个统一的、完整的分类系统，而是几个不尽完善的、看法分歧的分类系统。这样的分类系统难免或多或少地带有“人为的因素”。,按照目前比较一致的看法，地球上的所有生物被分成六界: 病毒界、原核生物界、真核原生生物界、真菌界、植物界和动物界。 据此，微生物的研究对象在六界生物分类系统中分属于病毒界、原核生物界、真核原生生物界和真菌界。,第一节 微生物的分类,一、微生物的分类单位,1、微生物的分类单位： 和高等动植物分类一样，微生物的分类单位也依次分为界（Kingdom）、门(Phylum）、纲（Class）、目（order）、科（Family）、属(Genus)、种（Species）。这是分类中所用的主要分类等级单位。 有时在两个主要分类单位之间，可添上次级分类单位，如“亚门”、“亚纲”、“亚 目”、“亚科”、“亚属”等。在科与属之间有时还可有“族”（Tribe）一级。 *人：动物-脊椎动物-哺乳动物-灵长目-人科,以啤酒酵母为例，它在分类学上的地位是： 真菌门Eumycophyta 子囊菌纲Ascomycetes 内孢霉目Endomycetales 内孢霉科E.domcetaceae 酵母属Saccharomyces 啤酒酵母SCerevisiae Hansen,2、几个概念：,1）种：种是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 种内的个体都是来自共同的祖先，有着相近的亲缘关系，同时在形态和生理特征上都表现出十分相似。,2）变种： 从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，必须与文献上记载的典型种的特征完全一致，才能鉴定为同一个种。实际上有时分离到的纯种，除了大多数指标符合典型种的特征外，还有某一个显然不同的特征，而此特征又是稳定的。我们就把这种微生物称为典型种的“变种”。 例如，巨大芽孢杆菌是以巴氏1884年原始报告为标准。1953年有人从土壤中分离到一株分解有机磷能力很强的巨大芽孢杆菌，而且性状稳定，因此将它称为巨大芽孢杆菌变种，称之为巨大芽孢杆菌解磷变种 。,3）亚种或小种（subspecies）： 在微生物学中，通常把在实验室中所获得的变异型菌株，称之为亚种或小种。 例如，大肠杆菌野生型的一个菌株称“ K12”，它不需要某种氨基酸。通过变异，可以从K12中获得需要某种氨基酸的生化缺陷型菌株。那么该菌株就称为K12的亚种或小种。,4）型（type）： 在自然界中，同一地区也可能有同一种微生物的各种类型同时存在着。它们彼此之间的区别往往不象变种那样显著，一般往往表现在菌体的化学组分（抗原等结构上） 例如伤寒杆菌应用噬菌体反应可分为20多个型；结核分枝杆菌依其寄主的不同，可分为人型、牛型和禽型。 型常用于变种以下的细分。,5）菌株或品系（strain）： 它是指来源不同的同一个种的纯培养物。 由于世界上不存在两个绝对相同的个体，因而从自然界中分离到的微生物纯培养物，尽管它们同属一个种，但由于来源不同，总会表现出细微的差异。 为了表现出这些细微的差异和工作方便，我们就采用菌株或品系这个名称来代表某个具体的微生物纯培养物。这样，从自然界中分离到的每一个微生物纯培养物都可以称为一个菌株或品系。 一般地讲，自然界中的“种”应是有限的，但菌株是无限的。,菌株的表示方法,常在种名后面写上编号、字母、地址或其它符号等。 例如生产淀粉酶的枯草杆菌BF.7658，生产蛋白酶的栖土曲霉3.942等。在微生物研究工作中，有时虽然是相同的种但是由于所用的菌株不同，其结果往往不完全一样。因此，我们在总结科研、生产的成果或撰写论文时，保藏或索取菌种时，通常不但要写出种名，而且要注明菌株号码。,类群（group series） 通常指属以下几个比较近似的种的集合。具体做法是选一些特征最为明显的典型菌株，再把和它近似的菌株放在一起归为一个类群。 例如，抗生素的主要产生菌链霉菌属，为了筛选新种的方便，把该属中的近似的种，归纳为14个类群。又如，曲霉属内，根据属内近似的种，归纳为18个类群。 有的时候，类群可用来表示两种微生物和介于这两种微生物之间的中间类型。例如大肠杆菌菌群就包括大肠杆菌、产气杆菌以及介于它们之间的中间类型。,二、微生物的命名规则,同一种微生物在不同的国家或地区常有不同的名称，这就是俗名。俗名在局部地区可以使用，但不便于交流，容易引起混乱。 学名（scientific name）：为在世界范围内便于交流和开展工作，要求给每一种微生物取上一个为大家所公认的科学名称，这就是学名 。,命名规则,采用生物学中一贯沿用的林奈（Linnaeus）氏的“双名法”。这种国际命名法的一般规则如下： （1）每一种具有显著区分的微生物，称之为“种”。 （2）每一个种给一个名字。其学名通常是用2个拉丁词组成。例如Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）。 （3）第一个词是属名，属名的第一个字母要大写。属名是拉丁词或希腊词或拉丁化了的其它文字所构成。它是一个名词，用以表示该属的主要特征。 例如芽孢杆菌（Bacillus）表示能形成芽孢的杆状菌。 属名有时可用人名或地名来表示。例如Pasteurella pestis (鼠疫巴斯德氏菌),志贺氏杆菌属（Shigella）。 属名在上下文重复出现的情况下，可以缩写。例如Bacillus可用Bac表示。,（4）学名的第二个词为种名。 种名是拉丁语中的形容词，表示微生物的次要特征。例如金黄色葡萄球菌（Stophylococcns aureus）中的aureus是形容词，意思是“金黄色的”。 种名也有用人名或地名来表示的。例如巴氏芽孢杆菌（Bacillus pasteurii），保加利亚乳杆菌（Lactobacteriurn bulgaricus）。 种名首字母不大写。 学名在印刷时，要用斜体字表示，或者在正排字下面加一条横线表示。例如Bacillus subtilis或者Bacillus subtilis。 值得注意的是，在属以上的名称，例如门、纲、目、科等，其名称第一个字母要大写，而且不印成斜体字。,（5）通常在种名的后面还跟着命名这个种的人的姓以及命名时间。这是由于自然界中的种实在太多了，大家都在命名，容易混淆误解，所以要在正式的拉丁名称之后附上命名人的姓名和命名时间。 例如Saccharomyces cerevisiae Hansen中第三个字母就是命名者的姓。 如果对以前的命名有所改动，也有一定的规则。,例如: 枯草芽孢杆菌，最早（1838年）由Ehrenberg描述，定名为“Vibrio subtillis(枯草弧菌)Ehrenberg，1838”。到了1872年，Cohn认为弧状不是它的特征，提出转属，但保留其种名，更名为“Bacillus subtilis（Ehrenberg）Cohn1872”。用括号把最初定名人保留下来，括号外加上改名人的姓氏和改名时间，借以标明这个种的命名演变过程。,在这里，有一点需要指出，种名后附加的人名，并非完全表示这个人是第一个发现和研究这种微生物的，而是指该人首先给它定名。 命名人的姓一律用正体字印刷。 综上所述，微生物学名的格式如下： 学名=属名+种名+(最初定名人)+后来定名人+命名时间 主要部分 次要部分（一般可省略） （6）有时，“种”还须区分成变种，就要在学名后面附加拉丁词表示之。例如枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis varniger）。,第二节 微生物的分类系统,一、细菌的分类系统 细菌的分类系统很不统一。目前比较有代表性的和有参考价值的分类系统有3个： 1、前苏联的克拉西里尼科夫著的细菌和放线菌的鉴定。 2、法国的普雷沃（Pervot）著的细菌分类学。 3、美国布瑞德（R.S.Bread）等人主持编写的伯杰氏鉴定细菌学手册（Bergeys Manual of Determinative Bacteriology）。 其中以伯杰氏鉴定细菌学手册一书影响较大，第八版（1974年）集中了14个国家的细菌学家参加了编写工作，内容丰富，描述详尽，被许多国家的微生物学工作者所采用。现在第九版也已相继出版。,伯杰氏鉴定细菌学手册,先按细菌的营养方式和能否进行光合作用等特征，将原核生物界 分为二门： 蓝色光合菌门和细菌门。 蓝色光合菌门只包括一类细菌。 细菌门再依据形态、生理、生态等特征将它们分为19部分。各部分以下再分科、属和种。科的划分以形态为主，属和种的划分则以形态和生理生化特征为主，结合生态特征和细胞化学组分，特别是 DNA中的 GC碱基对含量百分比值为依据，进行分类鉴定。,二、放线菌的分类系统,放线菌在国外比较有代表性的分类系统有两个： 1、前苏联的克拉西里尼科夫(1965)的分类系统 2、美国的瓦克斯曼（Waksma，1961）的分类系统。 在国内，中国科学院微生物研究所的有关分类专家，吸收了瓦氏和克氏两个分类系统的优点，结合自己的研究工作，提出了“放线菌分科分属检索表”。其具体内容可看中国科学院微生物研究所放线菌分类组编写的链霉菌鉴定手册一书。,三、真菌的分类系统,近年来在真菌分类方面，趋向于采用Ainsworth and Bisbys的真菌学辞典（Dictionary of the Fungi, sixth edition, 1971）所介绍的分类系统。该分类系统认为真菌不属于低等植物，而是属于单独成立的真菌界（Kingdom Fungi）。界以下分为粘菌门（Myxomycoto）的和真菌门（Eumycota）。 真菌门再分为以下亚门：5个亚门：,1鞭毛菌亚门（Mastigomycotina） 营养体单细胞或没有隔膜的菌丝体。孢子或配子，其中之一是可游动的。根据鞭毛的数目和位置，下分3个纲：壶菌纲、丝壶菌纲和卵菌纲。 2接合菌亚门(Zygomvcotina） 营养体是菌丝体；有性繁殖形成接合孢子。没有游动孢子。根据生活习性或生态特征可分为2个纲：接合菌纲和毛菌纲。 3子囊菌亚门（Ascomycotina） 营养体是有隔膜的菌丝体，极少数是单细胞。有性繁殖形成子囊和子囊孢子。根据是否形成子囊果和子囊果的类型以及子囊的结构，分为6个纲：半子囊菌纲、不整子囊菌纲、核菌纲、盘菌纲、虫囊菌纲和腔菌纲。,4担子菌亚门(Basidiomycotina) 营养体是有隔膜的菌丝体。有性繁殖形成担孢子。根据担子果的有无以及开裂与否，分为3个纲：冬孢菌纲、层菌纲和腹菌纲。 5半知菌亚门（Deuteromycotina） 营养体是有隔膜的菌丝体或单细胞。只有无性繁殖阶段，没有或还没有发现其有性繁殖阶段。根据菌丝体有无、发育程度以及分生孢子产生的场所不同，分为3个纲：芽孢纲、丝孢菌纲和胶孢菌纲。,关于酵母,虽然从系统分类上讲，它是分属于真菌的有关亚门中，但由于研究酵母的分类方法较研究一般丝状真菌特殊，更多地采用生理性状，因而逐渐形成了自己独特的分类系统。目前比较普遍采用的一种分类系统是罗德（Lodder）的酵母分类系统。 在1970年出版的酵母的分类研究 一书中，记载了39个属，372个种。根据有无有性过程，能否形成子囊孢子、掷孢子、担孢子、冬孢子以及孢子的数目、特点、形状等特征，将这些属种分别归为四大类：,第一类：能产生子囊孢子的酵母，归入子囊菌纲的原子囊菌亚纲的内孢霉目的3个科内。这3个科是：内孢霉科、酵母菌科和依精霉科。共22个属，179个种。 第二类：能产生冬孢子和担孢子的酵母,归入担子菌纲异担子菌亚纲的黑粉菌目的黑粉菌科内,共2个属,7个种。 第三类：能产生掷孢子的酵母，归入担子菌纲中不依附于其它目的掷孢酵母科内，共3个属，14个种。,第四类：不产生子囊孢子、冬孢子和掷孢子的酵母,其有性生殖已经丧失或未被发现,这一类酵母归为半知菌类中的丛梗孢目的隐球酵母科内。共 12个属，170个种。 关于真菌的分类研究，在国内也有不少人作专门研究。其中以中国科学院微生物研究所的一些真菌分类专家为代表，并有不少这方面的专著，如常见与常用真菌等。,第三节 微生物的鉴定,微生物的鉴定不仅是微生物分类学的一个重要组成部分，而且也是在具体工作中经常遇到的问题。例如在筛选菌种时，筛选出菌种以后，就要给它鉴定取名，这样便于记载和交流。,一、菌种鉴定的条件,鉴定菌种，至少要具备下面3个条件： 1待鉴定的菌种一定是纯种 如果菌种不纯，所观察到的现象则是混合现象，这样自然不会得到正确的结果。因此在鉴定之前，首先要将菌种纯化。 纯化方法，一般有2种：平板划线单菌落分离法和单细胞分离法。前一种操作简便，效果良好，适用范围广。,2选一本比较好的鉴定手册,鉴定时以此手册为标准，开展鉴定工作。根据多数人的经验，我们认为在细菌鉴定方面，使用伯杰氏鉴定细菌学手册一书较为合适。 在具体鉴定时，可参看中国科学院微生物研究所细菌分类组编著的一般细菌常用鉴定方法一书。 在放线菌鉴定方面，可以参看中科院微生物研究所编著的链霉菌鉴定手册（1975年）一书。 真菌的鉴定可参看中科院微生物研究所编著的常见与常用真菌（1973年）一书。荷兰罗德的酵母的分类研究（1970年）一书，对酵母菌的分类有很大的实用价值。,3要有合适的鉴定方法,微生物种类繁多，特征各异，性状有主次之分。因此，在鉴定某种微生物时，要选用合适的鉴定方法，确定主要的测试项目。 例如，鉴定的微生物若是霉菌，则菌落形态观察十分重要； 若是酵母菌，有性繁殖的方式、特征以及生理生化特征中的糖的发酵和同化，硝酸盐的同化就是主要指标。,二、菌种鉴定方法,（一）传统方法 在传统的分类中，微生物的分类依据，主要是形态特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。在鉴定时，我们就把这些依据，作为鉴定项目，进行一系列的观察和鉴定工作。,1形态学特征,（1）细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等； 细胞构造；革兰氏染色反应；能否运动、鞭毛着生部位和数目；有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置； 放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造；孢予的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。,（2）用群体形态群体形态特征： a.在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、粘稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等； b.在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等没半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况； c.在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜、均匀混浊、还是发生沉淀？有无气泡、培养基的颜色等。 如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。,2生理生化反应特征,（1） 利用物质的能力 a. 对各种碳源利用的能力(能否以 CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等) b. 对各种氮源的利用能力（能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等） c. 能源的要求（光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等） d. 对生长因子的要求（是否需要生长因子以及需要什么生长因子等）。,（2）代谢产物的特殊性 这方面的鉴定项目非常之多，例如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸、能否还原硝酸盐、能否使牛奶凝固、冻化等等。 （3）与温度和氧气的关系 测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适温度、最低温度和最高温度。 对氧气的关系，是看它好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。,Catalast test (触酶试验),正反应产气泡 负反应不产气泡 Trypticase soy agar (pH 7.3) 触酶试验 Trypticase 15.0 Phytane 5.0 Sodium chloride 5.0 Agar 15.0 P 370,Methyl red test (甲基红试验) 左 未接种 中 正反应(红色) 右 负反应(黄色) （4.4-6.0变红） 试剂：甲基红0.1g 95乙醇300ml 蒸馏水 200ml,左 未接种 中 正反应(红色) 右 负反应(黄色) MR-VP broth (pH 6.9) VP试验 Peptone 7.0 Dextrose 5.0 Potassium phosphate 5.0,VP test (伏普试验),Nitrate reduction test (硝酸盐还原试验),左1未接种 左2加A, B试剂正反应 右2加A, B试剂及鋅粉负反应 右1加A, B试剂及鋅粉正反应 Trypticase nitrate broth (pH 7.2) 硝酸盐还原试验 Trypticase 20.0 Disodium phosphate 2.0 Dextrose 1.0 Agar 1.0 Potassium nitrate 1.0,Urease test (脲酶试验) p378,正反应 (红色) 负反应 (黄色) Urea broth 尿酶试验 Urea broth concentrate 10.0 ml (filter-sterilized solution) Sterile distilled water 90.0 ml Note: Aseptically add the urea broth concentrate to the sterilized and cooled distilled water. Under aseptic conditions, dispense 3-ml amounts into sterile tubes.,Citrate utilization test (柠檬酸盐利用),左 未接种 中 正反应(蓝色) 右 负反应(绿色) Simmons citrate agar (pH6.9) 柠檬酸盐利用试验 Ammonium dihydrogen phosphate 1.0 Dipotassium phosphate 1.0 Sodium chloride 5.0 Sodium citrate 2.0 Magnesium sulfate 0.2 Agar 15.0 P368 Brom thymol blue 0.08,正反应(黑色) 负反应(黄色) SIM agar (pH 7.3)硫化氢试验 Peptone 30.0 Beef extract 3.0 Ferrous ammonium sulfate 0.2 Sodium thiosulfate 0.025 Agar 3.0,Hydrogen sulfide test (硫化氢试验),Litmus milk reactions (石蕊乳反应),左1未接种 左2产酸, 石蕊还原 产气, 凝乳 右2碱性反应 右1蛋白质分解,Oxidast test (氧化酶试验),正反应蓝色 负反应不变色 Trypticase soy agar (pH 7.3) 氧化酶试验 Trypticase 15.0 hytane 5.0 Sodium chloride 5.0 Agar 15.0,3生态学特征,生态学特征主要包括它与其它生物之间的关系（是寄生还是共生？寄主范围以及致病的情况）、在自然界的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是否耐高渗、是否有嗜盐性等）。,4血清学反应,很多细菌有十分相似的外表结构（如鞭毛）或有作用相同的酶（如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶）。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下（如电子显微镜或生化反应），仍无法分辨它们。然而利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，就可用来鉴别相似的菌种，或对同种微生物分型。 它是用已知菌种、型或菌株制成抗血清，根据它是否与待鉴定的对象发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种、型或菌株。 该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎双球菌等菌分成数十种菌型。,5生活史,生物的个体在一生的生长繁殖过程中，经过细胞数目的变化和不同的发育阶段。这种过程对特定的生物来讲，是重复循环的，常称为该种生物的生活周期或生活史（life history，life cycle）。 各种生物都有自己的生活史。在分类鉴定中，生活史有时也是一项指标。例如粘细菌就是以它的生活史作为分类鉴定的依据的。,6对噬菌体的敏感性,与血清学反应相似，各种噬菌体有其严格的寄主范围。利用这一特性，可以用某一已知的特异性噬菌体鉴定其相应的寄主，反之亦然。,（二）新技术新方法,1数值分类法 与传统分类法相反，利用电子计算机的数值分类方法是用菌株间的总相似性来归类的，它与传统的分类方法的主要差别在于所采用的原则方面。传统的分类方法对特征的处理有主次之分，列出双歧式检索表。数值分类对特征的处理是以“等重要原则”来衡量的， 即对所有的分类性状不分主次一律同等地看待，归群时通常以“单连锁比较”（即菌株两两进行相比），求其相似值而进行归类。应用此法时，为了尽量减少人为因素，必须测定很多的特征，一般50-6O个，多的在100个以上的性状。这样在整理结果时，工作量极大，而且每两菌株间的总相似值还需一一进行比较，所以必须借助于电子计算机才行。 这种方法得到的结果同传统分类法得到的结果基本上相一致。,2. 分子和遗传的分类法,(1)DNA中的碱基组成 同种M的DNA一定有着相同的碱基组分。相反,表型相似而遗传物质不同的微生物一定有不同的碱基组分。亲缘关系越远的种,其碱基对排列顺序差别就越大。再者,DNA碱基组分的排列顺序、数量和比例在细胞中很稳定，一般不受菌龄和外界因素的影响。 因此，分析微生物细胞中的DNA碱基组成可以作为分类中的指标，尤其是在属种一级的分类。这种分类方法已在某些细菌和酵母菌的分类中成功地得到应用。,据报导，细菌的GC百分比值（即：GC占4种碱基总量的mol百分比）为27-75，圆酵母属为32.4-60，假丝酵母为30-60。 Tm值 放线菌的GC百分比值为62-76，属间和属内的种间差别较小，因而用于放线菌的分类有一定的困难，必须和其它的性状结合比较才行。,(2)核酸分子杂交,从理论上讲