《微生物培养基》PPT课件.ppt

微生物培养基,第一节 培养基选择和配制的原则 第二节 工业发酵培养基 第三节 培养基的灭菌,第一节 培养基选择和配制的原则,培养基是人工配制的供微生物或动植物细胞生长繁殖和合成各种代谢产物所需要的、一定比例的多种营养物质的混合物，同时培养基也为微生物等提供除营养外的其他生长所必须的环境条件。 培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品质量和产量都有重要的影响。 所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。 大规模发酵生产中还必须重视培养基原料的价格和来源。,一、培养基的类型和用途,根据来源分： 根据主要成分或使用目的分： 根据生产工业的要求分：,营养不能太丰富，尤其是有机氮源； 无机盐浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色； 注意pH和湿度,营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高一些,除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等,二、培养基类型的选择,从微生物的特点来选择 液体和固体培养基选择 从生产实践和科学试验的不同要求选择 从经济效益方面考虑选择生产原料,三、培养基的配制原则,根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基 注意速效碳（氮）源和缓效碳（氮）源的配合使用，发挥各自的优势 营养成分的恰当配比（C/N一般取100 : 0.22.0） 渗透压，营养物质要有合适的浓度 合适的pH值（注意生理酸性盐、生理碱性盐和缓冲剂的加入） 氧化还原电位 考虑营养成分的加入顺序，避免生产沉淀,四、培养基成分配比的选择,参照前人所使用的较适合于某一类菌种培养基的经验配方 结合所用菌种和产品的特性 采用摇瓶、玻璃瓶等小型发酵设备，对碳、氮、无机盐和前体等进行逐个单因子试验 观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响 综合考虑各因素的影响 得到一个适合该菌种的培养基配方以得到高产,正交试验设计减少试验次数，确定培养基组分和浓度,方差分析了解哪些因素影响大，以引起注意,四、培养基成分配比的选择,氮源过多，菌体繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累； 氮源不足，菌体繁殖量少，影响产量。 碳源过多，容易形成较低的pH值； 碳源不足，菌体衰老和自溶。 C/N不当影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物形成。,注意速效碳、氮源和缓效碳、氮源的相互配合，选用适当的C/N。,一般发酵工业中C/N为100:（0.22.0） 但对于氨基酸生产，由于产物中含氮较多，因此C/N就要适当调整，如100:（1521）,第二节 工业发酵培养基,消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率 能产生最高的产品或菌体的浓度 能以最大的速率产生产物 副产品的得率最小 价廉并具有稳定的质量 来源丰富且供应充足 易于通气和搅拌 提取、纯化、废物处理等生产工艺过程都比较容易,在发酵工业中，必须使用廉价的原料来配制培养基，使之尽可能满足下列条件：,一、工业上常用的碳源,在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。,生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。,酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。,甲醇作为底物生产单细胞蛋白（SCP） 用烷烃进行有机酸、维生素等的生产,碳源供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物。,二、工业上常用的氮源,无机氮源：氨水，铵盐，硝酸盐等 有机氮源：玉米浆，豆饼粉，花生饼粉，棉籽粉，鱼粉，酵母浸出液等,氮源主要构成菌体细胞物质，作为酶的组成成分或维持酶的活性，调节渗透压、pH、Eh等。,三、无机盐,无机盐是微生物活动不可缺少的物质。 其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养渗透压、调节pH值和Eh等。 微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。,磷酸盐 硫酸镁 钾盐 微量元素,磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。 磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。 工业上常用K3PO43H2O、K3PO4和Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O等磷酸盐，也可用磷酸。, 除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不参与任何细胞物质的合成； 处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂； 不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成, 钾离子与细胞渗透压和透性有关； 是许多酶的激活剂； 促进糖代谢, Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂； 一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加； 特例：VB12的生产，由于钴是其组成成分，Co的需要量随产物的增加而增加，因此在培养基中需加入氯化钴以补充钴,四、生长因子,从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。 其功能是构成细胞的组成分，促进生命活动的进行。 生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物。 目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。,提供生长因子的农副产品原料,玉米浆 麸皮水解液 糖蜜 酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。,五、前体物质和促进剂,1. 前体物质,某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较大的提高。 有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。,2. 发酵过程中的促进剂和抑制剂,在氨基酸、抗生素和酶制剂发酵工业生产过程中，可以在发酵培养基中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂或抑制剂。,常用促进剂,表面活性剂洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温80、植酸等 二乙胺四乙酸 大豆油抽提物 黄血盐 甲醇,促进剂能促进产量增加的原因： 主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。,在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。,抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。,不同促进剂所起的作用：,起生长因素的作用； 可推迟菌体的自溶； 抑制某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化； 降低了生产菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成； 改变发酵液的物理性质，改善通气效果； 可与抗生素形成复盐，降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成等。,第三节 培养基的灭菌,在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存在和生长繁殖，不允许其它微生物共存，因此所有发酵过程，必须进行纯种培养 整个发酵过程必须牢固树立无菌观念，强调无菌操作 除了设备应严格按规定保证没有死角，没有构成染菌可能的因素外，必须对培养基和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防止杂菌和噬菌体的污染,灭菌：利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。 消毒：用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽胞。 消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。 只有不受杂菌污染，发酵过程才能正常进行。,一、灭菌的方法,干热灭菌法 火焰灭菌法 电磁波、射线灭菌法 湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌） 化学药剂灭菌法 过滤除菌法,进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是主要依据。 由于微生物对于热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160170、11.5h。 实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。,利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法。该法方法简单，灭菌彻底，但使用范围有限，仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。,利用电磁波、紫外线、X射线、射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌，以紫外线最常用。 紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用，但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。 紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。 250270nm之间杀菌效率高，以波长在260nm左右灭菌效率最高。 除紫外线外，X射线和射线也可进行灭菌。,一、灭菌的方法,利用饱和蒸汽进行灭菌 原理：水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，高压情况下可获得高温的水蒸汽。借助蒸汽的高温和蒸汽释放的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡 从灭菌效果来看，由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽胞杆菌来说，温度升高10时，灭菌速度常数可增加810倍，对营养细胞更高。另外蒸汽冷凝为水时还要释放出潜热，因此温度可进一步提高 蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠 湿热灭菌法是目前最常用的灭菌方法，一般的湿热灭菌条件为121，30min,某些化学药剂能与微生物发生反应而具有杀菌的作用。 化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。 化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,二、湿热灭菌的原理,1. 微生物的热阻,每一种微生物都有一定的最适生长温度范围，当微生物处于最低限温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质体和酶的基本成分蛋白质发生不可逆的变化，即凝固变性，使微生物在很短时间内死亡。 湿热灭菌就是根据微生物的这种特性进行的,一般无芽胞细菌，在60下经过10min即可全部杀死； 芽胞细菌的芽胞在100下经过几分钟至数小时才能杀死； 某些嗜热菌能在120下耐受2030min。 一般讲，灭菌的彻底与否 以 能否杀死芽胞细菌为标准。,二、湿热灭菌的原理,致死温度：杀死微生物的最低温度。 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。,在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 由于一般细菌、产芽胞细菌、微生物细胞和微生物孢子对热的抵抗力不同，因此，它们的致死温度和致死时间也有差别。,微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示,热阻：微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻：某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,二、湿热灭菌的原理,2. 微生物的热死规律对数残留定律,微生物热死：指微生物受热失活直到死亡，主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热凝固，丧失活力所致。,在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断被减少。 微生物热死速率可以用分子反应速率来表示，即微生物活体个数减少的速度与任一瞬间残存的菌数成正比。,二、湿热灭菌的原理,1/10衰减时间D： 活菌数在受热过程中减少到原菌数的1/10时所需的时间。,随时间的延长，加热灭菌后的残存菌数呈对数减少，且温度越高，死亡越快。通常必要的灭菌时间是110130，520min。 芽胞对热耐受力强，为此需要更高的温度并维持更长的时间。 对细菌芽胞来说，并不始终符合对数残留规律，特别是在受热后很短的时间内，培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性；高浓度盐类、色素能削减其耐热性。 随着灭菌条件的加强，培养基成分的热变性加速，特别是维生素，因此培养液灭菌一般都采用高温短时间加热的方式，这样可以达到彻底灭菌和把营养成分的破坏减少到最低限度的目的。,灭菌时间取决于污染的程度（N0）、灭菌的程度（残留菌数Nt）和k值。,一般考虑产芽胞细菌和细菌的芽胞之和作为计算依据。 在设计时常采用Nt0.001（即1000次灭菌中有一次失败的机会）。,反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。 在相同的温度下，k值愈小，则此微生物愈耐热。 同一种微生物在不同的灭菌温度下，k值不同，灭菌温度愈低，k值愈低。,在培养基灭菌的过程中，除微生物被杀死外，还伴随着营养成分的破坏，如糖液焦化变色、蛋白质变性、维生素失活、醛基和氨基反应、不饱和醛聚合、一些化合物发生水解等。因此，必须选择一个既能达到灭菌的目的，又能使培养基中营养成分破坏至最小的灭菌工艺条件。,二、湿热灭菌的原理,3. 培养基灭菌温度的选择,c反应物浓度，mol/L； t反应时间，min； k化学反应常数（随温度及反应类型而变），min-1。,A频率因子； E反应所需的活化能，J/mol； T绝对温度，K。,杂菌的死亡也属于一级动力学方程，与上式类似。 一般杀灭微生物营养细胞的E值约为2.091052.71105J/mol； 杀死微生物芽胞的E值约为4.48105J/mol； 一般酶及维生素等营养成分分解的E值为8.361038.36104J/mol。,由于灭菌时的活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E，因此，随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数培养基中营养成分分解的速率常数的增加倍数。即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高，超过了培养基营养成分破坏的速度。 据测定，每升高10，速率常数的增加倍数为Q10。 在热灭菌的过程中，同时发生微生物死亡和培养基成分破坏两个过程。 温度能加速其过程进行的速度，当温度升高时，微生物死亡的速度更快， 因此可以采用较高的温度，较短的灭菌时间，以减少培养基营养成分的破坏，这就是通常所说的“高温瞬时灭菌法”。,一般化学反应Q10为1.52.0； 杀灭芽胞的反应Q10为510； 杀灭微生物细胞的反应Q10为35左右。,灭菌温度较高而时间较短，要比温度较低时间较长效果好。 对同样的培养基进行126132、57min连续灭菌，其所得培养基质量要比采用120、30min的实罐灭菌好，可以得到较高的发酵水平； 对同一类培养基进行120、20min的实罐灭菌，其所得培养基的发酵水平高于120、30min的对照，而同样达到灭菌的要求。,生产实践亦说明：,高温灭菌所得培养基的质量比较好，并不意味着连续灭菌比实罐灭菌好。培养基灭菌方法的选择，必须从工艺、设备、操作、成本核算以及培养基的性质等具体条件来考虑决定。,三、少量培养基的灭菌,手提式灭菌锅结构示意图,手提式,立式,台式,卧式,连续灭菌也叫连消，就是将培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。其温度一般以126132为宜，总蒸汽压力要求达到4.41044.9104Pa以上。 培养基采用连续灭菌时，需在培养基进入发酵罐前，直接用蒸汽进行空罐灭菌，用无菌空气保压，待灭菌培养基流入罐后，再开始冷却。 灭菌时可采用各种加热器。 培养基的冷却方式有喷淋冷却式、真空冷却式、薄板换热器式几种方式。其过程均包括加热、维持和冷却,喷淋冷却优点是能一次冷却到发酵温度。 真空冷却只能冷却到一定温度，需在发酵罐中继续冷却，但它可以减少冷却用水，占地面积少。 板式换热器效率高，且利用冷培养液作冷却剂，既能冷却了热培养基，又预热了冷培养液，节约用水和蒸汽。,培养基冷却方式比较：,连消塔喷淋冷却连续灭菌流程,预热至60-70 ,132,40-50,维持数分钟,连续灭菌采用连消塔时，可在2030s达到预定灭菌温度，由维持罐来保持必需的杀菌时间。 采用喷射杀菌设备，蒸汽直接喷入生培养液，温度几乎立即上升到预定杀菌温度，由保温段管子的长度来保证必要的杀菌时间。 采用板式换热器，可在20s内达到杀菌温度，经保温保持必要的杀菌时间，然后再板式热交换器另一段20s内冷却到发酵温度。,间歇灭菌即实消，是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，将发酵罐和培养基同时灭菌，再冷却到接种温度备用。 其它灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。 有些设备也可采用SO2熏蒸灭菌，如葡萄酒发酵池、罐等。,（在夹套中）关好空气阀，蒸气上进下出，冲蒸气，压力大于2 kg/cm2（120），最好是45 kg/cm2（160）。 当罐内温度80，进蒸气口（蒸气阀）关掉，出蒸气口（排气阀）关小。打开空气阀，蒸气直接进罐，121，2030min。 从80100上升很快，大于100后温度上升很慢，到118时就开始计时，到计时25min时立即关掉蒸气阀。 关掉蒸气阀后通入无菌空气，使罐内一直保持正压（高于大气压，空气不会倒灌入罐内）。 （在夹套中）立即加自来水冷却，从下向上，使温度尽快降到55左右，到3738时关掉水，也有缓冲性。,因为有缓冲性，蒸气会冲到121。,在80以上冲入蒸气不容易产生冷凝水，罐内体积不会增加很大，培养基不会被稀释很大。,过程：,先蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差，不易翻动，吸水加热易成团，冷却困难。 针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、罐等。,培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫,影响培养基灭菌的因素除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间外，还有其它一些因素：,油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性，高浓度有机物会包于细胞周围形成一层薄膜，影响热的传递； 因此，在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。,pH值对微生物的耐热性影响很大。 pH值6.08.0，微生物最耐热； pH值6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。 所以，pH值愈低，灭菌所需的时间愈短。,培养基中的颗粒小，灭菌容易；颗粒大，灭菌难。 一般含有1mm的颗粒对培养基灭菌影响不大，但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。,培养基的泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。 对易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。 对有泡沫的培养基进行连续灭菌时更应注意。,液膜,空气,空气,连续灭菌和分批灭菌比较具有很多优点，尤其是当生产规模大时，优点更为显著。 当培养基中含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时，以