《微生物HX》PPT课件.ppt

大肠杆菌生长曲线的测定,大肠杆菌（介绍）,为革兰氏阴性短杆菌，大小0.5*1-3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，使人和动物倡导中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。大肠菌群数常作为饮用水和实物的卫生学标准。,主要特点,1、细菌，原核生物；肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，无细胞核有拟核；细胞质中的质粒作基因工程中的运载体。 2代谢类型：异养兼性厌氧型。 3与人体关系：正常状况下，可认为互利共生（高中）；在致病的情况下，可认为寄生。 4培养基中加入伊红美蓝，菌落呈深紫色，并有金属光泽，鉴别杆菌是否存在。 5.目前杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。 6在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者。 7基因组DNA为拟核中的一个环状分子。同时可以有多个环状质粒DNA,生长周期,细菌接种到均匀的液体培养基，在生长过程中，有以下生长周期。 1.迟缓期（数量维持恒定，或增加很少） 2.对数生长期（最大速率生长和分裂，细菌数呈对数增加） 3.稳定生长期（细菌数最高并维持稳定） 4.衰亡期（细菌死亡速率增加，活细菌减少）,细菌的生长一般指群体的生长，常常具有一定的规律性。 大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。,生长曲线,实验目的,1.了解细菌生长曲线特点及测定原理； 2.通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线； 3.学习用光电比浊法测定细菌的生长曲线。,目标与要求,1.会使用分光光度计测定光密度值 2会培养不同浓度的菌液 3会使用恒温摇床培养细菌 4能用已测定光密度值绘制大肠埃希氏菌生长曲线,实验原理,不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。 本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。,工作过程,5.结果处理,3.接种,1.备料、灭菌,4.培养,接受指令,6.报告结果,查找依据 制定计划,实施操作,7.评价质量,2.取样,项目八 大肠杆菌生长曲线的测定,工作准备,1.菌种：大肠杆菌(大肠埃希菌） 2.培养基：营养肉汤培养基（配法书上134页） 3.仪器和器具：721光电比色计，恒温摇床，无菌吸管10mL，试管，无菌平皿，酒精灯，接种环，培养箱，三角瓶。,操作步骤,接种培养 分别用10ml无菌吸管吸取5ml大肠杆菌过夜培养液(培养1012h)转入盛有100ml 营养肉汤 的三角瓶内，接种后，轻轻摇荡，使菌体混匀。将九组三角瓶置于摇床上，37,220r/min,振荡培养。间隔一段时间后（即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18h），从摇床上取下一瓶培养物(标记时间），置4 冰箱培养。,分光光度计比浊测定 每组取10支干净小试管，从不同时间培养菌液中摇匀各取3ml，将大肠埃希菌培养液进行适当稀释，使光密度在0.1-0.65之间，以没有接种的空白对照组培养基调零点，在550nm或600nm波长，1cm比色杯中依次进行测定OD值。测定从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。 经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数，才是培养的实际OD值,注意事项,1.选择试管时应选取质地相同，内外直径一致，管壁厚薄均匀的试管。在比色管架上以分光光度计的计值法选取则更为精确。 2.在生长曲线测定中，要用空白对照管的培养液校正光度计的零点。,3.测OD值前，培养液振荡，细胞均匀分布。后将比色杯的菌液倾入容器中，用水冲洗，水集于容器灭菌，用75%酒精冲洗比色杯。 4.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定 5.严格控制培养时间,实验报告:,将测定的OD600值填入下表：,绘制生长曲线 以光密度（OD值）为纵坐标，生长时间为横坐标，作出大肠埃希菌生长曲线。，并说明大肠杆菌生长特征。,思考题,(1)为什么比浊法测定细菌的生长只表示细菌的相对生长状况?它有何优点？ (2)用光电比浊计测定OD值应如何选择其波长？为什么要用未接种的牛肉膏蛋白胨液作空白对照？,（3）什么叫生长曲线？单细胞微生物的典型生长曲线可分几期？其划分的依据是什么 （4）如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么缺点,细菌细胞密度（OD 600）,实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。,使用方法,1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。 2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。） 3.根据所需波长转动波长选择钮。 4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。 5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。 6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。 7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。,注意事项,1该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。 2使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个