《生物技术实践》PPT课件.ppt

第19单元 生物技术实践,1、培养基的成分,一般都含有碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）、水和无机盐等营养物质； 另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质，例如：生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,考点1 微生物的利用,一、微生物的实验室培养课题1,2、培养基种类及用途,P211 课题1,教材 P26 旁栏信息,牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖。 基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨、NaCl和琼脂。 牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素,蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。 由于此培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性(7.0-7.2)，以利于细菌的生长繁殖。,MS固体培养基,液体培养基,无菌、无毒的环境,葡萄糖、氨基酸、 促生长因子、无机盐、微量元素等,矿质元素：大量元素和微量元素；有机物：维生素、甘氨酸、烟酸、肌醇、蔗糖、琼脂；,血清、血浆,生长素和细胞分裂素,多以36.50.5为宜,多数为7.2-7.4,95空气+5的CO2,5.8左右,18-22,每日光照12h,不同植物对各种条件的要求往往不同,煮沸消毒法：可以杀死微生物细胞和部分芽孢。 巴式消毒法：可杀死牛奶中的微生物，不会破坏其营养成分。 化学药剂消毒：用75%酒精擦手，用氯气消毒水源。,3、无菌技术,灭菌的方法： 灼烧灭菌：各种金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。 干热灭菌：用于能耐高温的、需要保持干燥的物品。 高压蒸汽灭菌：主要用于能耐高温的物品，如金属器械、玻璃、橡胶及一些药物的灭菌。,4、用牛肉膏蛋白胨培养基进行大肠杆菌纯化培养的基本操作程序,计算 称量 溶化 灭菌 倒平板,(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,高压蒸汽灭菌,4、用牛肉膏蛋白胨培养基进行大肠杆菌纯化培养的基本操作程序,(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,(2)纯化大肠杆菌,微生物接种最常用的方法：平板划线法和稀释涂布平板法。,1.平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。,平板划线法,2.稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。 稀释涂布平板法操作过程分两个步骤：即系列稀释操作和涂布平板操作。,系列稀释操作,涂布平板操作,微生物接种的核心是防止杂菌的污染，保证培养物的纯度,例、【名师P214跟踪训练2】在微生物的实验室纯化培养时，下列操作与杀灭细菌无关的是（ ） A.接种前用肥皂洗双手，再用酒精擦拭双手 B.接种前用火焰灼烧接种针（环） C.培养基在50左右搁置斜面 D.在酒精灯的火焰旁完成倒平板的操作,【解析】培养基搁置斜面其实是增大接种面积，是在无菌处理后进行的步骤，与杀灭细菌无关。,C,例、【名师P214跟踪训练4】（双选）下列有关微生物的接种方法的叙述，正确的是（ ） A.微生物接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法 B.平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作 C.稀释涂布平板法中的稀释是指将菌液进行一系列梯度的稀释 D.平板划线操作时，接种环在一次灭菌后可以连续划线,【解析】A.微生物接种的方法很多，题中的方法是最常用的两种方法，除此之外，还有斜面接种和穿刺接种等； D.在进行平板划线时，在操作的第一步及每次划线之前都要将接种环灼烧灭菌，且划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。,BC,二、土壤中分解尿素细菌的分离与计数课题2,1.筛选菌株的原理与方法,(1)原理：,微生物的选择培养,(2)方法：,根据目的菌株对生存环境的要求，到相应环境去寻找。,本实验提供的选择培养基(尿素是培养基中唯一的氮源)。,例、【名师P214跟踪训练5】下列所述环境条件下的微生物，能正常生长繁殖的是（ ） A.在加入尿素和葡萄糖的选择培养基上的尿素细菌 B.在人体表皮擦伤部位的破伤风杆菌 C.在新配制的植物矿质培养液中的酵母菌 D.在灭菌后的动物细胞培养液中的禽流感病毒,A,二、土壤中分解尿素细菌的分离与计数课题2,2统计菌体数目的原理及方法,(1)间接计数法(或活菌计数法)：,最常用的稀释涂布平板法,利用特定细菌计数板或血细胞计数板,(2)直接计数法：,设置重复组：为使结果接近真实值，需将同一稀释度加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落的平均数。,为了保证结果准确，一般选菌落数在30-300个平板进行计数。,每克土壤样品菌数= 某稀释倍数的菌落平均数稀释倍数 细菌培养时所用的稀释液体积,最常用的显微镜直接计数法,(1)对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。 (2)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 将尿素分解成了 。氨会使培养基的碱性 ，pH 。因此，我们可以通过检测培养基 变化来判断该化学反应是否发生。 (3)在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变 ，说明该细菌能够 。,3、课题延伸-,能分解尿素的细菌的鉴定：,脲酶,氨,增强,升高,pH,尿素,酚红,红,分解尿素,教材P26,三、分解纤维素的微生物的分离课题3,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。,纤维素酶由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。,纤维素,纤维二糖,葡萄糖,1、纤维素与纤维素酶：,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。,三、分解纤维素的微生物的分离课题3,2、实验原理,(1)刚果红染色法筛选的原理：,(2)选择培养基与鉴别培养基的应用,刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,三、分解纤维素的微生物的分离课题3,3、实验设计与操作步骤,刚果红的染色法有两种： 先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应； 在倒平板时就加入刚果红。,统计微生物菌落数目的方法,微生物接种方法 常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。,(1)稀释涂布平板法,(2)显微镜直接计数法 利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。,排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。(课本P22),4对照实验的目的及种类,(1)概念：,(2)目的：,(3)常用的对照方式有：,空白对照：空白对照是不给对照组任何处理因素。 标准对照：不设对照组，而是用标准值或正常值做对照的方式。 阳性对照：是给予对照组以已经证明是一种有效因素的处理因素。 自身对照：对照和实验均在同一对象上进行 相互对照：不设对照组，而是几个实验组相互对照，这种实验又称轮组实验法。,名师P212,指除被测条件(自变量)外，其他条件(无关变量)都相同的实验。,例、【名师P215跟踪训练6】用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是（ ） A未接种的选择培养基 B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基 C接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D接种了的选择培养基,【解析】将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可作为对照。对照实验应遵循的原则之一是单一变量原则，所以应与选择培养基一样接种、培养。,C,18-25, pH呈酸性无氧条件,重铬酸钾与其反应呈灰绿色,30-35,氧气充足,品尝、pH试纸检测,15-18接种,酒精含量控制在12%左右,常温， 无氧条件,pH检测,亚硝酸盐的检测方法,考向2 传统发酵工程技术的应用,1、果酒与果醋制作的比较,1、果酒与果醋制作的比较,【例】(双选)小李尝试制作果酒，他将葡萄汁放入已灭菌的发酵装置中进行试验(见图)，恰当的做法是 A加入适量的酵母菌 B一直打开阀b通气 C一直关紧阀a，偶尔打开阀b几秒钟 D把发酵装置放到4冰箱中进行试验,AC,例（10江苏卷）、下图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是 A.过程和都只能发生在缺氧条件下 B.过程和都只发生在酵母细胞的线粒体中 C.过程和都需要氧气的参与 D.过程-所需的最适温度基本相同,C,解析：过程、为酵母菌的呼吸作用，最适宜温度约为20左右；的最适宜温度为3035,果酒发酵装置：,1充气口？,排出 CO2,便于取样检查和放出发酵液,排气口胶管长而弯曲的作用？,防止空气中微生物的污染,果酒的发酵装置示意图,使用该装置制酒时，应该关闭 。,充气口,制醋时，应将充气口 。,连接气泵，输入氧气,在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的。,葡萄汁,2、腐乳的制作,(1)毛霉在腐乳制作中的作用：在豆腐的发酵过程中，毛霉等微生物产生的 能将豆腐的蛋白质分解成 ，脂肪酶可将脂肪水解为 。,蛋白酶,小分子的肽和氨基酸,甘油和脂肪酸,(2)毛霉的来源:传统腐乳的生产中，豆腐块上生长的毛霉来自 ，而现代的腐乳生产是在 的条件下，将 在豆腐上,这样可以避免 ，保证产品的质量. (3)腐乳的发酵有多种微生物的协同作用，如 、 、 、 等，其中起主要作用的是 。,优良毛霉菌种直接接种,其他菌种的污染,空气中的毛霉孢子,严格无菌,青霉,酵母,曲霉,毛霉,毛霉,(4)操作的注意： 盐的用量，在瓶口表面铺盐厚些，以抑制微生物的生长。 卤汤中酒精含量控制在12左右为宜。 防止杂菌的污染。,3、制作泡菜并检测亚硝酸盐含量,(1)乳酸菌是异养厌氧型细菌，在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌，乳酸杆菌常用于制作酸奶。,(2)在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐通过显色反应，与已知浓度的标准液对比，即可估算样品中的亚硝酸盐含量。,例、【名师P207跟踪训练2】在一个普通的锥形瓶中加入含有酵母菌的葡萄糖溶液，如右图所示。下图所示的坐标图中不正确的是（ ）,【解析】葡萄糖的量是一定的，且在发酵的后期酵母菌将会进行无氧呼吸，产生酒精，故酵母菌的数量不可能无限增加。,B,例、（2010山东高考理综）34. 生物柴油是一种可再生的清洁能源，其应用在一定程度上能够减缓人类对化石燃料的消耗，科学家发现，在微生物M产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油（如下图）。,（1）用于生产生物柴油的植物油不易挥发，宜选用_、_方法从油料作物中提取。 （2）筛选产脂肪酶的微生物M时，选择培养基中的添加的植物油为微生物生长提供_，培养基灭菌采用的最适方法是_法。 （3）测定培养液中微生物数量，可选用_法直接计数；从微生物M分离提取的脂肪酶通常需要检测_，以确定其应用价值；为降低生物柴油生产技术，可利用_ _技术使脂肪酶能够重复使用。 （4）若需克隆脂肪酶基因，可应用耐热DNA聚合酶催化的_技术。,PCR,压榨,萃取,碳源,高压蒸汽灭菌,显微镜直接计数,酶活性,（或：固定化细胞）,固定化酶,果胶是植物细胞壁及 的主要成分之一，它是由 聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水。在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁 。,一、果胶酶在果汁生产中的作用课题3,1、基础知识,果胶酶的作用：能够分解果胶，瓦解植物的 及 ，使榨取果汁变得更容易，而将果胶分解成可溶性的 。,胞间层,半乳糖醛酸,浑浊,细胞壁,半乳糖醛酸,（1）果胶和果胶酶,胞间层,果胶酶的组成：包括 、 和 等，因此果胶酶并不是一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称。,多聚半乳糖醛酸酶,果胶分解酶,果胶酯酶,纤维素酶由微生物分泌的一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，由于它们的协同作用，最终将纤维素分解成葡萄糖。,考向3 酶的应用,酶反应速度用单位时间内、单位体积中反应物的 或产物的 来表示。,2、酶的活性与影响酶活性的因素,主要有 、 和酶的 等。,（1）酶的活性：,是指酶催化 的能力，,一定化学反应,减少量,增加量,温度,pH,抑制剂,其高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的速度（速率）来表示。,（2）影响酶活性的因素：,(3)果胶酶的用量,生产果汁时，为了使果胶酶得到充分的利用，节约成本，需要控制好酶的用量。,3、探究温度、pH对果胶酶活性的影响及果胶酶用量的实验设计,（1）原理：,一系列不同温度梯度或pH梯度或者不同含量的果胶酶溶液，探究果胶酶的最适温度、pH或果胶酶用量。在实验中必须遵循单一变量原则。,（2）设计方案及流程（如图）,（3）在实际的操作过程中，需要注意的事项 可以选用10或以5作为温度梯度。 苹果、橙子和葡萄等水果都可以作为反应物，水果不用去皮。 果泥的用量可以采用5mL左右，果胶酶的用量可采用质量浓度为2%的果胶酶溶液2mL。 水浴时间可以为2030min。 过滤果汁时，漏斗中应放置滤纸。 探究pH对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成pH梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的pH可以通过体积分数为0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。 探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和pH对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是果胶酶的用量，其他因素都应保持不变。实验时可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的pH必须相同，否则将影响实验结果的准确性。,二、探究不同种类的加酶洗衣粉的洗涤效果,加酶洗衣粉除含有普通洗衣粉的成分外，目前常用的酶制剂有多种：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶，还有复合酶。其中应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。,复合酶,实验测定，单独使用蛋白酶或淀粉酶，得到的洗涤效果远不如把每种酶用量减半后放在一起使用的效果。即给定酶的用量，复合酶的效果远远超过单一酶的效果。 原因是淀粉酶分解了污渍表面的淀粉污垢，使蛋白酶能以更有效的方式向蛋白质污垢进攻。,实验设计,探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果,(1)实验原理,生活中的各种污渍主要是蛋白质、脂质、淀粉等多种不溶于水的有机物，这些有机物能在相应的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的作用下水解成易溶于水的小分子有机物。,(2)遵循原则,实验变量为不同种类的洗衣粉，设计时应遵循单一变量原则、对照原则。 有效的控制其他变量，如水的用量、污染物的量，所用实验用布的质地、大小，两种洗衣粉的用量，搅拌及洗涤时间。,将果胶酶与苹果泥分装 于不同试管，在10水浴 中恒温处理10分钟(如图A)。 将步骤处理后的果胶酶 和苹果泥混合，再次在10水浴中恒温处理10分钟(如图B)。 将步骤处理后的混合物过滤,收集滤液,测量果汁量(如图C)。,例3.工业生产果汁时,常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高出果汁率,为研究温度对果胶酶活性的影响某学生设计了如下实验：,在不同温度条件下重复以上实验步骤,并记录果汁量,结果如下表 根据上述实验，请分析回答下列问题： (1)果胶酶能破除细胞壁，因为果胶酶可促进细胞壁中_的水解。 (2)实验结果表明，当温度为_时果汁量最多，此时果胶酶的活性_。当温度再升高时，果汁量降低，说明_。 (3)实验步骤的目的是：_。,果胶,40,最高,温度升高，降低了酶的活性,使得酶与果泥处于同一温度条件下,三、固定化酶和固定化细胞的比较,原因：,细胞个大，酶分子很小,个体大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋的材料中漏出,实验：酵母细胞的固定化,(1)酵母细胞的活化,干酵母+蒸馏水摇匀，放置1h,(2)配置0.05mol/L的CaCl2溶液 （用于使海藻酸钠形成凝胶珠）,(3)配制海藻酸钠溶液,用酒精灯小火或者间断加热加热，边加热边搅拌，反复几次，直至完全溶化,(4)海藻酸钠溶液和酵母细胞混合,将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌,(5)固定化酵母细胞,（二）用固定化酵母细胞发酵,（一）制备固定化酵母细胞,葡萄糖溶液+固定好的酵母细胞，置于25下发酵24h，观察。,例（2010江苏）图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图下列叙述正确的是（双选） A刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液 B图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠,C图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触 D图1中制备的凝胶珠可以直接转移到图2装置中,BC,1、血红蛋白的提取,(1)凝胶色谱法：,(2)电泳：,(3)步骤：,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，也称做分配色谱法。,利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,考向4 生物技术在其他方面的应用,单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。,b,B,A该致病基因在常染色体上 B1的致病基因来自于1，和2 C3与1、2的基因型均相同 D4号为纯合子的概率是13,一对等位基因经某种限制性核酸内切酶切割后形成的DNA片段长度存在差异，用凝胶电泳的方法分离酶切后的DNA片段，并与探针杂交后可显示出不同的带谱。根据电泳所得到的不同带谱，可将这些DNA片段定位在基因组的某一位置上。现有一对夫妇生了四个孩子，其中4号个体患病。该家庭成员的基因经上述处理后得到的带谱如右图所示。据图分析，错误的是,D,【2011广东 5】.以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是 A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂 B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少 C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测 D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,D,(1)细胞内复制DNA的条件,模板：DNA两条母链 原料：4种脱氧核苷酸 酶：解旋酶、DNA聚合酶 能量：ATP,(2)PCR的反应条件,一定的缓冲溶液-维持pH； DNA模板(或目的基因)； 分别与两条模板链相结合的两种引物； 四种脱氧核苷酸； 耐热的DNA聚合酶； 还需要控制温度,2、生物体内DNA复制与PCR反应的区别,3、植物有效成分的提取方法总结,利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来,使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发后得到芳香油,通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油,水蒸汽蒸馏 分离油层 除水过滤,粉碎、干燥 萃取、过滤 浓缩,石灰水浸泡、漂洗 压榨过滤静置 再次过滤,适用提取玫瑰精油、薄荷油等挥发性强的芳香油,适用范围广，原料颗粒尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中,适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取,例、（09江苏卷）下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有（双选） A.提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞 B.用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA可去除蛋白质 C.蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNA D.蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化,BD,解析：C中透析用以除去小分子物质，DNA是大分子物质， D是常规方法比如用十二烷基磺酸钠，可以根据其分子大小及所带电荷性质进行分离纯化,D项考查凝胶色谱法分离蛋白质的原理，相对分子质量越大的通过凝胶色谱柱的速度越快，故D错误。 A正确，洗涤的目的是去除杂蛋白以利于后续步骤的分离纯化，加入的是生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。B正确，哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器，提纯时杂蛋白较少。C正确，血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液（如果操作都正确，能清楚的看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、