《生物样品前处理》PPT课件.ppt

现代生化分离技术 Separation Methods in Biochemistry,2,第二章 生物样品前处理,第二章 生物样品前处理,3,第二章 生物样品前处理,第一节 样品分离的预提取 第二节 细胞的破碎与分离,第一章 绪论,4,第二章 生物样品前处理,第一节 样品分离的预提取（前处理）,前处理的目的：对目标组分进行初步富集，对干扰成分进行去除；,2.1.1 概述,预处理材料的种类和特点,动物细胞反应液 植物细胞反应液 微生物细胞反应液 植物组织提取液 动物组织提取液,“发酵液” “产物”，胞内or胞外？,组织,5,第二章 生物样品前处理,2.1.2 植物组织提取物的制备,植物组织材料来源部位不同，前处理方法不同。 叶片、根、茎清洗去泥沙、灰尘等杂质（-4C -30C低温保存备用）； 种子（大豆、莲子）、中药提取的原材料等泡涨，粉碎。,6,第二章 生物样品前处理,一些酶必须从富含酚、多酚的绿叶、水果和其它组织中提取，大量的分类化合物给提取带来困难。在完整的细胞组织中，酶和酚类物质处于彼此隔离的状态，细胞组织被破坏后，彼此接触，很容易发生酶促反应，反应产物苯醌和单宁类还会继续和酶蛋白质反应，破坏目的酶的活性。所以要在预处理阶段去除酚类化合物。,2.1.2.1 植物组织中酶的提取,7,第二章 生物样品前处理,例子：植物组织中二磷酸核酮糖碳酸酶的提取,1. 步骤：,100g新鲜叶片切成小片（打孔器、切片）置入提取液中（稳定酶活性）PVPP预浸泡（不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮，可溶性PVP聚乙烯吡咯烷酮，）间歇高速搅拌（充分接触混匀）纱布过滤滤液加入PVPP重复轻搅（重复一次）离心去除PVPP酶粗提液。,8,第二章 生物样品前处理,2. 条件讨论,低温（45度），器皿、溶液预冷、操作要快； 57倍于固形材料的提取液，搅拌不产生气泡（气泡不利于酶活稳定）； PH6.57.0，中性，未知蛋白酶要远离等电点； PVPP优良，不溶性； PPO抑制剂，DTT、2-ME； 蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲磺酰氟）酒精溶解，剧毒。,9,第二章 生物样品前处理,2.1.2.2 多糖提取,重要活性多糖 步骤：原料粉碎醇醚回流脱脂水提取粗提液 去蛋白策略：Sevag法，蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性 TCA法，低浓度的TCA可沉淀蛋白质，离心后即可除去蛋白质。,10,第二章 生物样品前处理,2.1.2.3 细菌重组蛋白的提取,重组蛋白：工程菌可表达大量的重组目的蛋白，40%总蛋白含量，但易形成包涵体（蛋白质以不溶形式包涵在细胞质中）。,11,第二章 生物样品前处理,例：E. coli.中提取重组蛋白,1. 步骤：,酶解菌体细胞：离心收集菌体溶菌酶去核酸（DNase）电泳检测； 清洗包涵体：去除杂蛋白，保证包涵体蛋白不被溶解； 溶解包涵体：释放目的蛋白； 目的蛋白再折叠：恢复活性,12,第二章 生物样品前处理,第二节 细胞的破碎与分离,微生物代谢产物： 胞外产物（氨基酸、细菌碱性蛋白酶、糖化酶等） 胞内产物（大多数蛋白质、类脂） 微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组DNA技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。,2.2.1 概述,13,第二章 生物样品前处理,2.2.2 常用破碎方法,机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press法等；对物料的挤压和剪切作用 非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等；,14,第二章 生物样品前处理,2.2.2.1 珠磨法,原理：,进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂（玻功小珠、石英砂、氧化铝d1mm）一起快速搅拌，细胞与研磨剂之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。 玻璃珠（石英砂、氧化铝等研磨剂）+ 细胞悬浮液研磨释放胞内物,15,第二章 生物样品前处理,破碎过程产生热能，要注意热交换，温度控制夹套冷却，实验室预冷器皿； 适用于绝大多数微生物细胞的破碎 高破碎率，但难以实现固液分离，浆状,特点：,16,第二章 生物样品前处理,高压匀浆器； 细胞悬浮液受高压作用快速从针形阀射出经历剪切、碰撞、高压至常压变化后导致细胞壁和细胞膜的破坏释放胞内物,2.2.2.2 高速匀浆法,原理,17,第二章 生物样品前处理,特点,增大压力和破碎次数，对于高浓度的细胞或难破碎的细胞常采用多次循环操作的方法 3060Mpa最佳 易造成堵塞的团状或丝状真菌不适合 较小的革兰氏阳性菌（细胞壁厚20-80nm，肽聚糖成分多40-90%）不适合,18,第二章 生物样品前处理,2.2.2.3 超声破碎法,可听波（次：地震、海啸）2020KHz（超）。 空化现象指超声波在传播过程中与组织中的气核或微气泡相互作用，使其突然爆破，产生巨大的瞬间压力，从而改变组织结构的现象。 空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎,工作原理,19,第二章 生物样品前处理,适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加冷水） 工作频率25130 KHz 功率正比于破碎效果 细胞浓度低有利于空化泡的形成及爆破，破碎效果好于粘稠液 不同的微生物需采用不同的破碎参数（功率、破碎时间、间隔时间、循环次数），G-G+酵母。 易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由，基因使敏感活性物质失活），可加入保护剂N2、PMSF等,特点：,20,第二章 生物样品前处理,溶菌酶（细菌），-3，3-葡聚糖酶，-1，6-葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶，细胞壁溶解酶（复合酶），酵母。酶有专一性。 特点： 条件温和，核酸泄出量少，选择性释放产物（可从细胞不同位置） 价格高，限制了大规模应用 通用性差，不同菌种需选择不同的酶，最佳条件不易确定； 产物抑制的存在：在溶酶系统中，甘露糖蛋白酶，葡聚糖葡聚糖酶,2.2.2.4 酶溶法,外加酶,21,第二章 生物样品前处理,将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 特点： 对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质变性。 自溶后，细胞悬浮液粘度上升，过滤速率下降。,自溶法,22,第二章 生物样品前处理,2.2.2.5 化学渗透法,原理：使用某些可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性）的化学试剂，使胞内物质有选择地渗透出来，称为化学渗透法。,23,第二章 生物样品前处理,表面活性物质：促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞破碎 EDTA螯合剂：与结构中ca2+或Mg2+螯合，使其原有结构破坏而破裂 有机溶剂：甲苯、苯、二甲苯、氯仿、高级醇等，能被细胞壁中的类脂吸收，使胞壁膜溶胀，导致细胞破碎； 变性剂：与水中氢键作用，减弱水的极性，使疏水性化合物溶于水,24,第二章 生物样品前处理,特点,选择性释放产物。可使一些较小分子量的溶质，如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 通用性差，某种试剂只能作用于某种特定类型细胞； 时间长、效率低，胞内物一般释放率不超过80%； 有些化学试剂有毒，在其后产物提取精时，需分离除去。,25,第二章 生物样品前处理,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,2.2.2.6 反复冻结融化法,原理：,26,第二章 生物样品前处理,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥,2.2.2.7干燥法,27,第二章 生物样品前处理,X-press法：将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,2.2.2.