《杂交育种》PPT课件-2.ppt

2019/5/20,1,第七章 杂交育种,2019/5/20,2,第一节 杂交育种概述 第二节 常规杂交育种 第三节 原生质体融合育种,主要内容,2019/5/20,3,第一节 杂交育种概述,2019/5/20,4,杂交育种(hybridization)：指通过基因重组的方法获得新基因型的一项育种技术。 杂交的目的：使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种。,杂交育种:,2019/5/20,5,1. 可以获得新品种。 可以提高菌株性能，避免诱变饱和现象。 3. 可以总结遗传规律，促进遗传学理论发展。,杂交育种的意义,2019/5/20,6,原核生物(细菌和放线菌) 杂交过程: 两个亲本菌株的染色体发生部分转移，形成部分结合子(merozygote)，最后经交换、重组直致重组体产生。 真菌杂交过程： 通过有性生殖(sexual reproduction)或准性生殖(Parasexual reproduction)来完成。,一、微生物杂交理论基础,2019/5/20,7,原核微生物杂交方式： 接合(conjugation) 转化(transformation) 转导(transduction),（一）原核微生物杂交理论基础,2019/5/20,8,接合(conjugation),接合：指供体菌（“”）通过性菌毛与受体菌（“”）直接接触，通过F因子转移遗传物质的重组过程。 通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，称为接合子（conjugant）。,E. coli接合电镜图,2019/5/20,9,2019/5/20,10,含F质粒菌株杂交结果,2019/5/20,11,2019/5/20,12,（二）真核微生物杂交理论基础,真核微生物杂交方式：有性杂交、准性杂交和原生质体融合等。,1. 有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。 凡能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都可通过与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。,2019/5/20,13,2. 准性杂交(parasexual hybridization) 准性生殖是一种类似于有性生殖，但更为原始的生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而发生低频率基因重组并产生重组子。 准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌中。,2019/5/20,14,2019/5/20,15,二、微生物杂交育种基本程序,2019/5/20,16,2019/5/20,17,1. 原始亲本菌株的选择 原始亲本：微生物杂交育种中具有不同遗传背景的优质出发菌株。 选择：主要根据杂交目的。 选择产量高、代谢快、产孢子能力强、无色素、泡沫少、粘性小等发酵性能好的菌株为原始亲本。 它们可以来自生产用菌或诱变过程中的某些符合要求的菌株，也可以是自然分离的野生型菌株。 标记特征：原始亲本还应该具有野生型遗传标记，如抗性标记等性状。,杂交育种中亲本和培养基的选择,2019/5/20,18,2. 直接亲本的选择 直接亲本：在杂交育种中由原始亲本经诱变剂处理后选出的具营养缺陷型标记或其他遗传标记，又通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株。 要求： a.各自的性状优良、突出，经过重组后产生杂种优势； b.最好采用具有明显遗传性状差异的近亲菌株为直接亲本。,2019/5/20,19,3. 培养基 常用的培养基:完全培养基(CM)、基本培养基(MM)、补充培养基(SM)和有限培养基(Limited medium，LM) 。 有限培养基：是专供异核体菌株生长使用的培养基。通常在基本培养基或蒸馏水中加入适量(10-20)的完全培养基，加入的量只限两直接亲本菌株稍许生长，以提供相互接触、吻合的菌丝体需要。加量过多，菌丝体也随之增多，会影响异核体菌株的检出。,2019/5/20,20,一般杂交亲本用营养缺陷型或抗药性突变型等遗传标记，作为选择重组体的标准和依据。 此外，还要利用亲本菌株本身具有的某些特殊遗传性状作为辅助标记，如温度敏感性、孢子颜色、代谢产物产量高低等。,杂交育种的遗传标记,2019/5/20,21,（一）常规杂交育种 细菌、放线菌:接合(conjugation)、转化(transfor- mation)、转导(transduction)等技术。 真菌:有性生殖、准性生殖,三、杂交育种方法,（二）原生质体融合(protoplast fusion)育种 通过酶解破除细胞壁后制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲合力限制，甚至可打破种属间遗传障碍，获得远缘杂交重组体，这种特殊的杂交方式称为原生质体融合育种。,2019/5/20,22,第二节 常规杂交育种 （放线菌杂交育种）,2019/5/20,23,放线菌杂交育种,1955年在天蓝色链霉菌中最早发现。 放线菌的遗传结构与细菌相似，所以基因重组过程类似于细菌。通过供体菌向受体菌转移部分染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重组。 但放线菌的细胞形态和生长习性与霉菌很相似，具有较复杂的形态分化，生长过程中产生菌丝体和分生孢子，所以育种操作方法与霉菌基本相同。 放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间。,2019/5/20,24,一、放线菌杂交原理,2019/5/20,25,1接合 由两个基因型不同的直接亲本菌丝体混合培养，体细胞间接触和融合，在双方细胞增殖过程中两个遗传类型不一致的细胞核的部分染色体进行转移和遗传信息交换，形成部分结合子。,二、放线菌杂交过程,2019/5/20,26,部分结合子是由一个供体细胞的部分染色体和一个受体细胞整套染色体相结合，同时存在于一个细胞质中。也有时两个亲本细胞的染色体都是以部分染色体进行结合。,a,b,2019/5/20,27,2杂合系和重组杂合系形成 部分结合子形成后，在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色体进行一次交换，产生了杂合系，交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状，并且在染色体末端具有串连的重复体。 这种重复结构，有的成为一个二体区，有的是两个二体区。,2019/5/20,28,杂合系和重组杂合系形成 在复制过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，由于位置不同而成为杂合状态，产生了各种不同基因型的重组杂合系。,2019/5/20,29,3重组体 以上产生的杂合系或重组杂合系，在以后进一步繁殖过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进行几次交换。根据交换的位置不同，所携带的基因种类、数量也不一致，形成了一系列基因型的环状染色体细胞，从产生的菌落中可检出不同类型重组分离子。 杂合系是形成重组体所必须的阶段。,2019/5/20,30,放线菌杂交技术： 混合培养法 玻璃纸法 平板杂交法,三、放线菌杂交技术,2019/5/20,31,混合培养法,1 准备直接亲本,2斜面混合接种,5 杂合系分析,4 检出重组体,3 制备单孢子悬液,2019/5/20,32,P,平板杂交法,2019/5/20,33,第三节 原生质体融合育种,2019/5/20,34,一、原生质体育种与原生质体融合育种,1953年，weibull等首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌细胞获得原生质体，并首先提出原生质体概念。 1955年，Mcquillen首次发现巨大芽孢杆菌原生质体的再生方法，使之恢复成正常细胞并能继续生长繁殖。 20th 70s以来，各种原生质体操作技术已成为工业微生物育种的重要手段，并取得了较大成就。,细胞壁被酶水解剥离，剩下由原生质膜包围着的原生质 部分成为原生质体。,2019/5/20,35,原生质体再生育种 原生质体诱变育种 原生质体转化育种 原生质体融合育种 ,常见原生质体育种方法：,2019/5/20,36,原生质体再生育种是将微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。原生质体再生育种不用任何诱变剂处理，而能产生比常规诱变还高的正变率。,原生质体再生育种,2019/5/20,37,是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。 1983年，Kim等首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌 (Micromonospora rosaria)取得成功以来，应用逐渐广泛，已在抗生素、酶制剂、有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用。,原生质体诱变育种,2019/5/20,38,原生质体转化育种,是将整条染色体DNA或片断DNA或质粒DNA转化原生质体的技术，转化育种为实现定向育种的目标和原生质体育种技术开拓了一个更广阔的领域。 一般来说，用染色体DNA或其他线状DNA转化原生质体效率较低，而用质粒DNA能得到高频转化率，完整质粒、单链质粒和重组质粒都能成功地转化。,2019/5/20,39,原生质体融合育种,用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。 近年来，该技术已成为生物界颇受瞩目的研究领域，是细胞生物学中迅速发展的方向之一。,2019/5/20,40,研究表明，由聚乙二醇(PEG)诱导的原生质体融合是微生物获得高频重组的主要方法，种内的融合频率可高达27，种间的融合频率也可达10，比常规的杂交重组频率提高数千倍以上。 最近出现的电场诱导融合又将融合率提高10倍。,2019/5/20,41,原生质体融合育种的优缺点：,第一，大幅度提高亲本之间重组频率。 不少链霉菌通过原生质体融合，其后代的重组率达1左右，比准性重组率高2020000倍。如果融合前结合紫外线处理，重组频率可达2030。,2019/5/20,42,第二，扩大重组的亲本范围。 常规杂交的亲本间必须具有感受态，有些菌株由于其表面结构缘故而无法用常规方法进行杂交重组。 原生质体由于完全或部分去除了细胞壁，因此，实现常规杂交无法做到的种间、属间、门间等远缘杂交。,2019/5/20,43,第三，原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组较多，集中双亲本优良性状机会更大。 第四，与常规诱变育种途径相比，还具有定向育种的特点。,2019/5/20,44,不足之处： 原生质体融合后DNA交换和重组随机发生，增加重组体分离筛选的难度。 细胞对异体遗传物质的降解和排斥作用，以及遗传物质非同源性等因素也会影响原生质体融合的重组频率，使远缘融合杂交存在较大困难。,2019/5/20,45,原理：原生质体融合本质是二亲本菌株去除细胞壁后的一种体细胞杂交育种方法。 两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶去除细胞壁后，在促融剂诱导作用下，两个裸露的原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组目的，最后对重组体进行生产性能、生理生化和遗传特性分析。,二、原生质体融合育种的原理,2019/5/20,46,三、原生质体融合育种的步骤,一）直接亲本及其遗传标记选择 二）双亲本原生质体制备与再生 三）亲本原生质体诱导融合 四）融合重组体(称为融合子)分离 五）遗传特性分析与测定 六）生产性能筛选,2019/5/20,47,一）直接亲本及其遗传标记的选择,从育种角度，一般把诱变系谱中筛选获得的不同“正突变株”作为直接亲本进行融合，通过交换、重组，使优良性状集中于重组体中，以加快育种速度。 现在一般认为原生质体融合的亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势。,2019/5/20,48,遗传标记除常用的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热致死(灭活)、孢子颜色和菌落形态等作为标记。 1. 如果目的是为了进行遗传分析，应该采用带隐性基因的营养缺陷型菌株或抗性菌株。 2. 如果从育种角度进行原生质体融合，由于多数营养缺陷型菌株都会影响代谢产物的产量(尤其对一些抗生素产生菌)，选择营养标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的营养缺陷型。,2019/5/20,49,3. 采用灭活标记。把双亲中任何一方的原生质体用热灭活(如50 2h 或60 5min)或用紫外线、药物灭活，使细胞内的某些酶或代谢途径钝化，然后和另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体。前者为供体，后者为受体，这样可以省去营养缺陷型的遗传标记。 采用灭活标记融合频率较低，但重组体产量较高。,2019/5/20,50,二）原生质体制备与再生,1 原生质体制备 活性原生质体制备过程包括原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤。 细胞去壁后，原生质体从中释放出来，此过程为原生质体分离。 去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法。,2019/5/20,51,酶法分离原生质体：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸法或摇瓶振荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下酶解细胞壁。 注意：不同的微生物选择不同的酶。 细菌、放线菌：溶菌酶 真菌：蜗牛酶、纤维素酶、葡聚糖酶,2019/5/20,52,酶法分离原生质体的影响因素,(1)培养基组成 (2)菌体培养方式 (3)菌体菌龄 (4)稳定剂 (5)酶解前的预处理 (6)酶系和酶的浓度 (7)酶的作用温度和作用pH值 (8)菌体密度 (9)酶解方式,2019/5/20,53,2原生质体的观察,水解酶作用于菌体后，必须定时取样观察原生质体分离的程度，以确定酶解终点。,(1)低渗爆破法：直接在显微镜下观察原生质体在低渗溶液中吸水膨胀、破裂的过程。 细胞壁去除完全的原生质体吸水破裂后细胞彻底解体，没有残骸；如果原生质体破壁不完全，还有部分剩余细胞壁，则原生质体从无细胞壁处吸水，膨胀破裂并留下一个残存的细胞形态；对于那些正常细胞或酶解程度不彻底的细胞，吸水后由于细胞壁的保护作用，不会胀裂，能维持正常形态。,2019/5/20,54,(2)荧光染色法：原生质体混悬液用0.050.1的荧光增白剂(VBL)染色，离心弃染料、洗涤后在荧光显微镜下观察(波长用360440nm)，如发出红色光则为完全原生质体，如发出绿色光则表明还有细胞壁成分存在。,2019/5/20,55,3原生质体的收集和纯化,(1)过滤法：适用于丝状微生物(如放线菌、霉菌及丝状微藻等)，根据细胞大小，选用孔径略小于细胞的砂芯漏斗，过滤。原生质体由于外层细胞膜柔软可变形，可以由比它小的微孔中穿过，而未酶解细胞或细胞团却不能，由此原生质体和正常细胞分离而得到纯化。对一些细胞较大的微生物(如微藻)，也可采用微孔径网筛来过滤原生质体。,2019/5/20,56,(4)漂浮法：适用于一些细胞较大的微生物，原生质体的比重小于细胞，能在一定渗透浓度的溶液中漂浮在液面上，从而得到纯化。,(3)界面法：将原生质体分离液置于两种液体的混悬液中，这两种液体密度有区别，上层密度小于下层密度，离心后原生质体就集中在两层液面交界处而得到纯化。,(2)密度梯度离心法：用蔗糖或氯化铯等制成浓度梯度溶液，由于密度差别，经离心后原生质体漂浮于上部，未酶解细胞和细胞碎片沉于溶液下部。,2019/5/20,57,4原生质体的活力鉴定,染色鉴定法： 荧光素双醋酸酯(FDA)染色法，FDA本身不发荧光，被细胞吸收酯解后产生具有荧光的极性物质。荧光物质不能透过质膜，存在于活细胞内，这样就可通过观察原生质体是否发生荧光来判断其活性有无，能发出荧光的原生质体具有活性。,2019/5/20,58,5 原生质体的保存,低温下保存： 在一般冷藏条件下保存时间很短，有些种类几小时就失活。 在液氮中超低温状态下保存时间可长些。方法是加入5的二甲亚砜(DMS)或甘油等其他保护剂，迅速降温保藏。,2019/5/20,59,6 原生质体再生,原生质体具有细胞全能性，但本身不能立即进行分裂、增殖，必须首先重新合成细胞壁物质，恢复至完整细胞形态，才能进一步生长、分裂和增殖，这就是原生质体的再生。 （1）原生质体再生的过程 大分子合成与原生质体生长，这一时期原生质体主要是合成细胞器成分，表现为原生质体的体积增大； 细胞壁合成与再生，此时期主要合成细胞壁物质，组装、恢复成完整细胞； 分裂能力恢复并开始分裂繁殖成为正常的细胞形态和菌落。,2019/5/20,60,（2） 原生质体再生的影响因素,菌体生理状态 稳定剂 细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统的稳定液，如放线菌常用1015蔗糖溶液；霉菌常用盐溶液系统，如NaCl、KCl、MgSO4等组成的稳定液，浓度为0.3-1.0mo1/L； 酶浓度和酶作用时间,2019/5/20,61,再生培养基组成 残存菌体的分离 原生质体密度 排除再生培养基上的冷凝水,2019/5/20,62,（3）再生方法 一般采用双层平板法：其下层为再生培养基，琼脂含量约2，制成平板后除去冷凝水，取原生质体悬浮液0.1ml加到平板上，然后上层加入含0.8琼脂或0.4琼脂糖的半固体同一成分的培养基3-10 ml，迅速摊布均匀，使原生质体植于固体培养基中，有利于再生。,2019/5/20,63,（4）再生率,通过再生率测定，可以检验并进一步找出最佳的原生质体制备和再生条件及再生培养基。,再生频率()(再生培养基上总菌落数-酶处理后未原生质体化菌落数)/原生质体总数100(C-B)/(A-B)100。式中， A：总菌落数，未经酶处理的菌悬液涂布于平板生长的菌落。 B：未原生质体化细胞，酶解混合液加蒸馏水破坏原生质体，涂布平板后生长的菌落。 C：再生菌落数，酶解混合液加高渗溶液，涂布于再生培养基上生长的菌落。,2019/5/20,64,三）原生质体融合,原生质体融合过程（以霉菌为例） 两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定液中，在PEG的诱导下，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞，异核体的细胞在繁殖过程中发生核融合，形成杂合二倍体，通过染色体交换，产生各种重组体，称融合子(fusant)。,2019/5/20,65,原生质体融合的影响因素,现在普遍采用的融合手段是PEG介导的化学融合法。有学者研究认为低浓度PEG有稳定原生质体和促进核分裂作用，也有利于细胞壁的形成和再生。,（1）融合剂,化学融合剂,2019/5/20,66,促融机制：PEG本身是一种特殊的脱水剂，它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用，进而改变质膜的流动性能，降低原生质膜表面势能，使膜中的镶嵌蛋白质颗粒凝聚，形成一层易于融合的无蛋白颗粒的磷酯双分子层区。 在Ca2存在下，引起细胞膜表面的电子分布的改变，从而使接触点的质膜形成局部融合，出现凹陷，构成原生质桥，成为细胞间通道并逐渐扩大，直到两个原生质体全部融合。,2019/5/20,67,PEG相对分子量： 真菌一般采用40006000， 放线菌常用10001500， 细菌用15006000。 PEG常用浓度：3050 真菌在30左右效果较好，低于20失去稳定性，导致原生质体破裂，高于30会引起原生质体皱缩，过高还会产生中毒现象。,2019/5/20,68,物理融合剂 电场,电融合：主要分为两个阶段： 在交流(AC) 电场作用下，细胞受到电介质电泳力F的作用，根据电泳现象，原生质体向电极的方向泳动。与此同时，细胞内产生偶极化，促使原生质体相互粘连，并使细胞沿电力线方向排列成串，待融合细胞之间形成紧密接触； 在外加瞬间高频直流强电压作用下，以50s的时程脉冲冲击原生质体粘连点，扰乱原生质体膜的分子排列，使之穿孔，然后发生原生质体膜复原过程，相连接的原生质体发生融合。,2019/5/20,69, 温度和时间 丝状真菌适宜融合的温度约为30； 放线菌通常在常温(约20)下进行融合。 细菌原生质体融合的适温往往偏低，据认为4或20比37更好。 总的来说在2030下进行融合效果较理想。 融合处理时间从l min到1h，但绝大多数微生物在110min，处理时间过长，原生质体因脱水而失活，时间过短则融合率低。,2019/5/20,70, 亲株的亲和力和原生质体的活性 亲合力是指双亲亲缘关系，最好是亲缘关系近些，远缘融合染色体交换后重组体不稳定，易分离，影响融合效果。,2019/5/20,71, 无机离子 在PEG介导融合时，通常需要一定浓度的Ca2+和Mg2+，能更有效地促进融合。通常所用浓度为CaCl2 0.05 mol/L，MgCl20.02mol/L。 电融合时，混合液中离子存在对电场及原生质体偶极化形成偶极子有一定影响，会干扰融合，一般采用糖或糖醇为稳定剂，尽量减少无机离子。,2019/5/20,72, 其他条件 细胞密度 一般具有活性的原生质体浓度要在107108 ml-1，不少于106 m1-l，并且应采用年轻的、含残余菌丝少的原生质体进行融合，这些都有助于提高融合频率。,2019/5/20,73,四）融合体再生、检出与分离,1 融合体再生,融合体的再生，包括融合体细胞壁合成、重建和融合体的再生，具体过程与一般原生质体再生相同。,2019/5/20,74,2 融合体的检出与分离, 利用营养缺陷型标记选择融合体, 利用抗药性选择融合体, 用灭活标记选择融合体, 利用荧光染色法选择融合体, 双亲对碳源利用不同而检出融合体, 融合体的其他选择方法,2019/5/20,75,五）融合重组体检出与遗传特性分析,检出和鉴别融合重组体细胞的主要依据是亲本的遗传标记，同时还要结合DNA含量和孢子形态等遗传学和形态学方面特性加以确定。 另外还要对重组体含染色体的拷贝数及稳定性进行研究，综合研究其各种性质，从而判断它是异核体、杂合二倍体、还是重组二倍体或单倍体。,2019/5/20,76,1 重组体的检出和鉴别的方法, 直接选择法 把PEG处理或电场处理的融合产物直接分离在基本培养基或选择性培养基平板上，其中融合体由于营养互补，经过再生，长出的菌落为融合菌落，同时还涂布于完全培养基上，以作对照，则可直接检出融合细胞。 一般丝状真菌核融合需要基本培养基的强制培养，都是采用直接选择法。 此法虽简便易行，但难以检出那些表型延迟而基因却已重组的融合重组体 。,2019/5/20,77, 间接选择法 把融合产物先分离到完全培养基上，使原生质体再生形成菌落。但是在该培养基上融合体和非融合的亲本原生质体都会生长。所以需要把再生菌落上的孢子进一步用影印法，分离到各种选择性培养基上，从长出的菌落分离重组体。 这种方法连表型延迟的融合体也能检出来，但对融合频率低的菌株来说，在完全培养基上产生的绝大多数菌落是由没有融合的原生质体形成的，要检出重组体需要花相当大的人力和时间。,2019/5/20,78, 钝化选择法 用灭活原生质体和活性原生质体融合。 先把亲本中的