细胞生物学研究方法.ppt

第二章 细胞生物学研究方法,第一节 细胞生物学基本研究方法,（一）普通光学显微镜 (light microscope),1. 构成： 照明系统 光学放大系统 机械装置和支架 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。,、显微镜技术,小鼠肾小管切片示线粒体，苏木精染色,3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 显微镜的分辨力 R=0.61/NA 为入射光线波长； NA为镜口率 sin/2； n=介质折射率； =镜口角（样品对物镜镜口的张角） 普通光镜的最大分辨率是0.2微米。,不同光源的波长,不同介质的折射率,（二）荧光显微镜 (fluorescent microscope),特点：光源为短波光； 有两个特殊的滤光片； 照明方式通常为落射式。,Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green,用于观察能激发出荧光的结构。研究组织和细胞特异蛋白等生物大分子分布、细胞内物质吸收和运输规律等,（三）相差显微镜 phase contrast microscope,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 用途：观察未经染色的玻片标本。,（四）微分干涉差显微镜 differential interference contrast microscope （DIC）,利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,（五）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描； 能显示细胞样品的立体结构； 分辨力是普通光学显微镜的3倍； 可分层扫描后三维重建，显示样品的立体图像。,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue),（六）暗视野显微镜 dark field microscope,聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。 可观察 4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。,（七）偏光显微镜 polarizing microscope,用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。 进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器 （与起偏器方向垂直的偏振片）。 载物台可以旋转。,淀粉,（八）倒置显微镜 inverse microscope,物镜与照明系统颠倒； 用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。,（九）现代光学显微镜的发展趋势,采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体； 自动化与电子化。,二、电子显微镜,以电子束作光源，电磁场作透镜。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成； 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍； 用于观察超微结构（小于0.2m）。,（一）透射电子显微镜 transmission electron microscope, TEM,由光路系统、真空系统和电路控制系统三个部分组成 光路系统由电子枪和电磁透镜系统(物镜、中间镜和投影镜)组成 真空系统用于保证电子束的高速运动。,TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM,制样技术,1. 超薄切片 超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机制作。,2. 负染技术,用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,Negative Stained Archaebacteria,3. 冰冻蚀刻 freeze-etching,亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。,培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示 Clathrin衣被,（二）扫描电子显微镜 scanning electron microscope,20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构 分辨力为310nm 用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像,Scanning electron microscope（ SEM）,人类红细胞,酵母,人类精子,（三）扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope，STM,根据隧道效应设计，非破坏性测量。 分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.01nm。 三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,（四）高压电子显微镜 high voltage electron microscope,（五）原子力显微镜 atomic force microscope,加速电压高，用于观察较厚的生物组织,三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察 用于观察不导电的生物材料 活细胞表面、生物大分子空间伸展,三、显微操作技术 micromanipulation technique,是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。,显微操作仪,转基因显微操作过程,四、细胞的分离和分析技术,（一）、离心分离技术 是分离细胞器及各种大分子基本手段。 悬浮液中的颗粒的沉降速度与其质量、密度、体积相关，还与悬浮介质的密度和黏度相关。,1. 差速离心法 Differential centrifugation,特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。,Low speed,High speed,Differential centrifugation,2. 移动区带离心法 moving-zone centrifugation,用于体积差别较小的颗粒的分离 制备有密度梯度的离心介质。介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。,3. 等密度离心法 isodensity centrifugation,用途：分离密度不等的颗粒。 特点： 介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,（二）、流式细胞技术 flow cytometry,用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。,（三）、激光捕获显微切割技术 laser capture microdissection,在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，红外激光熔化膜，膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上。,五、细胞培养技术 cell culture,基本条件： 营养 环境 支持物,无菌操作技术,体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。,体外培养细胞的方式,群体培养（mass culture）：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层； 克隆培养（clonal culture）：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。,群体培养（左）和克隆培养（右）,原代培养 （primary culture）：从生物供体分离取得组织或细胞后在体外进行的首次培养。 传代培养（subculture）：将培养的细胞从原培养瓶中加以分离，经培养基稀释后再接种于新的培养瓶中。 细胞系（cell line）：原代培养细胞成功传代即为细胞系。 细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 冻存和复苏的原则：慢冻快融,第二节 细胞生物学其他研究方法,一、其他的一些分离技术 （一）层析技术 chromatography,层析技术亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,亲和层析(affinity chromatography) 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离 离子交换层析(ion exchange chromatography) 利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离,（二）分子水平的分离技术,（一）、DNA提取 共同步骤：裂解细胞、溶解DNA、去除污染的RNA、蛋白质、多糖、脂类和其他大分子。 （二）、RNA提取 避免RNA酶的降解,二、细胞融合,通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。 同核体：相同基因型的细胞融合而成。 异核体：不同基因型的细胞融合而成。 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。 诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒 ）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。,三、细胞化学技术 cytochemistry,是将形态和功能相结合的细胞科学。它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下, 运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构及生理活性物质原位地显示。因而对于探索化学成分、生理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的意义。 组织细胞染色的范围一般可分为：蛋白质类（氨基酸)、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类，采用的方法通常为化学结合物理溶解显示及酶-底物反应。,单核细胞呈 弥散弱阳性,中性粒细胞呈 粗颗粒强阳性,过氧化物酶染色,四、免疫细胞化学技术 immunocytochemistry,将组织和细胞作为抗原，与其相应的特异抗体产生抗原抗体反应，并借助荧光色素、酶、胶体金、铁蛋白等显示系统，在被测组织和细胞所相应的位置显示出来。由于抗原抗体系统具有高度的特异性和敏感性，能够将细胞形态学和功能代谢紧密的结合起来，进行观察和分析。,组织切片,组织切片,直接法,间接法,Ab1-荧光,Ab1,Ab2-荧光,免疫荧光法原理图,单色荧光染色,双色荧光染色,多色荧光染色,五、放射自显影术 autoradiograph,旨在追踪某些物质在体内、组织或细胞中的分布与代谢径路。 放射性同位素或放射性同位素的标记物注入动物体内或加入培养基中，间隔一定时间取材，制成标本，在暗室中于标本表面涂以液体原子核乳胶，置暗处曝光，数日后再经显影和定影处理，或经染色后光镜观察，在放射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原成黑色的微细银颗粒。,图1 正常大鼠，两侧纹状体均可见放射性浓集 图2 部分损毁一侧PD模型大鼠，右侧纹状体放射性浓集程度明显减弱 图3 完全损毁一侧PD模型大鼠，右侧右侧纹状体放射性浓集程度更加降低,放射自显影对帕金森病大鼠模型多巴胺转运蛋白的观察,六、原位杂交技术 in situ hybridization,具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。 在不破坏组织和细胞的原有结构和不提取核酸的情况下，显示组织细胞中特定的低含量的核酸序列。,原位杂交原理,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,七、绿色荧光蛋白 green fluorescent protein,绿色荧光蛋白(GFP)是一类生物发光蛋白，由238个氨基酸组成，是典型的桶形结构，包含折叠和螺旋，将荧光基团包含在其中，防止它被周围环境淬灭。 当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。,用于研究靶蛋白在活细胞内的位置及动态变化及定量测定与分析。,细胞膜上绿色荧光蛋白标记TGF-II型受体的单分子图像,八、PCR 技术,聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）扩增技术，即体外试管内DNA的扩增，以高特异性、高灵敏度、高效率及忠实性等特点，在生命科学研究领域产生着巨大的影响。 其原理类似于DNA在体内的复制过程，利用DNA半保留复制的原理，使模板DNA、引物、DNA聚合酶、四种dNTP原料和合适的缓冲液体系，经过变性、复性和合成的反复循环，达到体外快速扩增特异性DNA片段的目的。,PCR原理,九、Southern印迹杂交技术,是体外分析特异DNA序列的方法，用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互