环氧化酶2VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及意义.doc

环氧化酶-2VEGF在非小细胞肺癌组织中的表达及意义【摘要】 目的:观察环氧化酶-2（COX-2）、VEGF在NSCLC及非肿瘤性病变肺组织中的表达，探讨其在NSCLC发生发展及肿瘤血管生成中的作用。方法:制作71例NSCLC和21例非肿瘤性病变肺组织共92例的组织芯片，采用免疫组化技术检测COX-2、VEGF的表达。结果:COX-2、VEGF在NSCLC组织中的阳性表达率分别为77.47%、77.06%，均显著高于非肿瘤性病变肺组织（14.29%，38.10%）。COX-2的表达与肺癌组织的病理类型有关;VEGF的表达与肿瘤大小、淋巴结转移与否有关。NSCLC组织中COX-2与VEGF表达具有相关性。结论:COX-2和VEGF在NSCLC的发生、发展、转移过程中发挥调控作用，可作为判断NSCLC转移和预后的重要生物学指标。COX-2可能通过调节VEGF的表达参与NSCLC组织中血管生成。 【关键词】 非小细胞肺癌;COX-2;血管内皮细胞生长因子;组织芯片 研究发现环氧化酶-2（COX-2）在多种肿瘤组织中高表达，并参与肿瘤血管形成，由COX-2催化合成的前列腺素可能作为血管生成剂促进肿瘤的形成。在人前列腺癌组织中发现COX-2与VEGF表达基本一致，而其增高幅度与肿瘤恶性程度相关 1 。本研究旨在探讨COX-2与VEGF在人非小细胞肺癌组织中的表达、意义及相关性。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 研究对象:收集选择青岛市立医院胸外科2004年1月2005年10月间手术切除非小细胞肺癌标本73例（术前均未行放、化疗）及肺良性疾病21例作为组织对照，所有标本均经病理检查证实并取自病变的典型区域。其中NSCLC病理组织学诊断及分级采用WHO1999年肺癌组织学分类、分级标准 2 ，分期采用1997年国际抗癌联盟（UICC）制定的肺癌临床分期标准 3 。所有标本均及时经10%中性福尔马林固定，熔点为5658的石蜡包埋。 1.1.2 研究材料:鼠抗人VEGF单克隆抗体购自Santa Cruz公司，鼠抗人COX-2单克隆抗体、PV9000通用型免疫组化检测试剂盒、非免疫小鼠IgG均购自北京中杉公司。每批实验均分别取COX-2、VEGF阳性片作阳性对照，并分别用同种动物非免疫血清代替一抗作阴性对照。 1.2 方法 1.2.1 组织芯片的制作:观察每一组织标本的HE切片以确定蜡块穿刺位置;用Beecher Instru-ments生产的组织芯片仪，从蜡块标记部位逐个取出2mm组织芯，随即推入受体蜡块上已打好的孔内，制作成组织芯片蜡块;将制作好的组织芯片蜡块面向下置于模具中，60烤箱中放置1h，使蜡块重新熔为一体。随后将蜡块连同模具一同取出，静置自然冷却至室温，然后置于-4冰箱中7min，将蜡块与模具剥离;将制作好的组织芯片蜡块3m4m连续切片，冷水漂片，挑选组织芯完整的切片转移至56水中展片，用预先制备好的APES载玻片捞片。 1.2.2 组织芯片免疫组化标记:主要步骤为:组织芯片切片常规脱蜡至水;内源性过氧化物酶阻断;组织微波抗原修复;滴加适当稀释的一抗（其中COX-2:1600稀释，VEGF:1300稀释），湿盒内冰箱中4过夜;分别滴加试剂1、试剂2，均在湿盒内37孵育20min;DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。 1.3 结果判定 COX-2、VEGF免疫组化染色结果判断标准采用Kim 4 阳性细胞半定量积分法:光镜下分析， 在排除非特异性染色的前提下，A以切片中阳性细胞染色强度分级，0级:阴性;1级:弱阳性;2级:中等强度阳性;3级:强阳性。B以切片中阳性细胞比例评分，染色的范围标记为0（0）、1（1%25%）、2（26%50%）、3（51%75%）、4（76%100%）;两积分相加之和作为最后的染色积分，其积分2认为阳性，其余均为阴性。 1.4 统计学分析 应用SPSS软件包11.5进行数据处理，以P<0.05确定差异有显著意义。 2 结果 2.1 组织芯片的质量本研究制成2个组织芯片蜡块，蜡块完整，肉眼可见组织芯排列整齐，外形为圆形或类圆形，无缺损现象。芯片HE染色结果:点阵分布均匀，组织芯完整，只有2例组织芯缺失不全，1例组织芯出现移位，为统计方便取有效例数92例（其中NSCLC组71例、对照组21例），有效率为97.87%，仍可代表原样本信息，不影响统计学分析。71例NSCLC病例中男性53例，女性18例;年龄38岁81岁，平均年龄62.3岁;鳞状细胞癌38例（高分化1例，中分化22例，低分化15例），腺癌31例（高分化12例，中分化13例，低分化6例），巨细胞癌2例;发生淋巴结转移33例;期36例，期23例，期10例，期2例。 2.2. COX-2、VEGF在两组组织中的表达及其与NSCLC患者临床病理特征的关系COX-2蛋白阳性染色主要定位于胞浆，为清晰棕黄色弥漫性分布，强阳性组可见明显的颗粒状着色。COX-2在NSCLC组织中的阳性表达率及与患者临床病理特征的关系见表1、表2。 表1 NSCLC、非肿瘤性病变肺组织中COX-2、VEGF的表达略 表2 NSCLC中COX-2、VEGF的表达与临床病理特征的关系 （略） VEGF蛋白阳性染色主要定位于胞浆，呈棕黄色颗粒状，以肿瘤组织周边部位及坏死区域周围肿瘤细胞表达较强，肿瘤组织内巨噬细胞、成纤维细胞及部分血管内皮细胞也呈阳性。VEGF在NSCLC组织中阳性表达率及与患者临床病理特征的关系见表1、表2。 2.3. NSCLC组织中COX-2与VEGF的关系 （见表3） 表3 COX-2与VEGF在NSCLC组织中表达的相互关系略 在NSCLC组织中COX-2表达阳性的55例组织中VEGF表达阳性的有46例（占83.64%），而COX-2表达阴性的16例组织中VEGF表达阳性的仅有8例（占50.00%），经四格表 2 检验COX-2与VEGF表达密切相关（P<0.05）。 3 讨论 环氧化酶（COX）是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶，其中COX-2亚型为可诱生型，在正常生理状态下多数组织内检测不到，而在一定因素如生长因子、炎症介质、促癌剂及一些癌基因产物等刺激下表达增加。本实验应用组织芯片技术免疫组化染色检测71例NSCLC组织、21例非肿瘤性病变组织中COX-2的表达水平，发现COX-2在NSCLC组织中阳性表达率为77.46%，显著高于非肿瘤性病变组织。并在组织切片中观察到，NSCLC组织中分布的部分增生腺体也可见COX-2高表达，而在正常肺组织内的腺体少有表达，因此认为COX-2与肺癌的发生发展密切相关。目前国内外报道肺癌组织中COX-2的表达与淋巴结转移及TNM分期关系的结果尚不一致，虽然本实验中未发现COX-2的表达水平与淋巴结转移及TNM分期相关，但这并不足以否定其参与肺癌的浸润转移。Kozaki等 5 用高转移肺癌细胞系实验显示，COX-2表达与肿瘤侵袭转移能力呈正相关，其抑制物可减少肺转移，同时还观察到转移肺癌细胞内多种炎性介质及促血管生成物质增加，认为肺癌细胞可能在转移过程中利用COX-2参与炎症过程，类似炎症细胞穿越血管壁，从而促进肺癌血行转移。我们的研究中发现COX-2表达与淋巴结转移无关，但在肺腺癌组织中显著高表达，表明COX-2的高表达可能在肺腺癌的早期即已发挥促进癌细胞血行转移的作用，而未参与淋巴转移途径，这与肺腺癌血行转移较早而淋巴转移较晚的临床特点相一致。 血管内皮细胞生长因子（VEGF）是目前被认为诱导血管形成最重要的生长因子。VEGF由许多肿瘤细胞释放，在原位肿瘤细胞中表达，特异地作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞增殖，介导血管形成。本实验71例NSCLC中VEGF阳性率为76.06%，显著高于非肿瘤性病变组织，表明VEGF的表达与肺癌的发生有关。本实验结果显示VEGF表达仅与肿瘤大小、淋巴结转移具有相关性，在肿瘤直径大于3cm及淋巴结有转移的NSCLC组织中VEGF表达更显著，阳性率更高，表明VEGF与NSCLC的生长、转移有关。 多项研究表明肿瘤细胞中COX-2的过度表达与新生血管的形成有关，在多种恶性肿瘤中COX-2和VEGF表达存在相关关系，而其增高幅度与肿瘤恶性程度相关 1，6，7 。本实验结果也显示COX-2与VEGF存在相关性，提示COX-2可能通过调节VEGF的表达来促进非小细胞肺癌新生血管的形成。我们分析其中的机制可能有两方面，COX-2催化花生四烯酸的代谢产物PGE 2 、PGI 2 、TXA 2 等可直接促进血管内皮细胞的移位和生长因子诱导的血管形成 8 。增加促血管生成因子，如VEGF的表达。COX-2催化产物前列腺素与相应受体结合，通过cAMP和cAMP依赖蛋白激酶（PKA）途径诱导VEGF的表达 9 。Williams等 10 将Lewis肺癌细胞植入COX-2基因缺乏的小鼠体内，观察到血管生成和肿瘤生长均受抑制，提示COX-2通过上调VEGF的表达从而促进血管生成。但Tamura等发现VEGF可以诱导人微血管内皮细胞COX-2和PGE 2 的表达，且这种作用 可以被选择性COX-2抑制剂NS398抵消 11 。这些研究进一步支持COX-2和VEGF之间存在密切关系，但是两者之间究竟是何种正反馈机制有待于更深入的研究。【参考文献】 1 Liu XH，Kirschenbaum A，Yao S，et al.Upregulation of vascular endothelial growth factor by cobalt chloride-simulated hypoxia is medi-ated by persistent induction of cyclooxygenase-2in a metastatic human prostate cancer cell lineJ.Clin Exp Metastasis，1999，17（8）:687694.2 Travis WD，Colby TV，Corrin B，et al.WHO histological typing of lung and pleural tumors.3rd ed.Berlin:Springer-Verlag，1999:547.3 Mountain CF.Revisions in the international system for staging lung cancer.Chest，1997，111:17101717.4 Kim YB，Kim GE，Pyo HR，et al.Differential cyclooxygenase-2expression in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the uter-ine cervixJ.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，60（3）:822829.5 Kozaki K，Koshikawa K，Tatematsu Y，et al.Multi-faceted analyses of a highly metastatic human lung cancer cell line NCI-H460-LNM35suggest mimicty of inflammatory cells in metastasis J.Oncogene，2001，20（31）:42284234.6 Leung WK，To KF，Go MY，et al.Cyclooxygenase-2upregu-lates vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis in human gastric carcinomaJ.Int J Oncol2003，23（5）:13171322.7 Raspollini MR，Amunni G，Villanucci A，et al.COX-2status in relation to tumor microvessel density and VEGF expression:Analysis in ovarian carcinoma patients with low versus high survival ratesJ.On-col Rep，2004，11（2）:309313.8 Majima M，Isono M，Ikeda Y，et al.Siginificant roles of in-ducible cyclooxygenase（cox）-2in angiogenesis in rat sponge implantsJ.Jpn J Phar，1997，75:105114.9 Eibl G，Bruemmer D，Okada Y，et al.PGE（2）is generated by specific COX-2activity and increases VEGF production in COX-2-expressing human pancreatic cancer cells J.Biochem Biophys ResCommun，2003，306（4）:887897.10 Williams CS，Tsuji