连环蛋白P120在肝细胞癌中的表达及其意义.doc

连环蛋白P120在肝细胞癌中的表达及其意义 作者：张毅 朱瑾 杨占宇 杨世忠 李晓武 董家鸿 【摘要】 目的 检测肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中连环蛋白P120(P120 catenin，P120ctn)的表达，分析其与临床病理特点之间的关系。方法 用免疫组化技术检测58例HCC、17例癌旁肝硬化及8例正常肝组织中P120ctn的表达。结果 58例HCC组织中有34例P120ctn(58.6%)膜表达弱阳性或缺失，30例(51.7%)胞质表达，异常表达总比例为65.5%(38/58)；17例癌旁肝硬化组织中有6例(35.3%)膜表达弱阳性，8例(47.1%)胞质表达，异常表达总比例为47.1%(8/17)；8例正常肝组织全部表现为胞膜正常表达，无胞质表达。P120ctn的异常表达与HCC的包膜形成、淋巴浸润、有无卫星灶、肿瘤分化等相关(P<0.05)，而与性别、年龄、瘤体积大小、分期等无关(P>0.05)。结论 HCC中存在较高比例的P120ctn异常表达，主要表现为胞膜表达缺失伴胞质异常染色，P120ctn可以作为预测HCC转移潜能和预后状况的有价值的指标。 【关键词】 连环蛋白P120 肝细胞癌 【Abstract】 Objective To investigate in vivo expression of P120ctn in hepatocellular carcinoma (HCC) and analyze its relationship with pathological characteristics. Methods Immunohistochemical method was performed to detect expression of P120ctn in tissues from 58 cases with HCC, 17 with hepatic cirrhosis and eight healthy controls. Results Of 58 cases with HCC, reduced membranous expression of P120ctn was seen in 34 cases (58.6) but cytoplasmic expression in 30 (51.7%), with abnormal expression rate of 65.5 (38/58). Of 17 cases with hepatic cirrhosis, six cases (35.3) had decreased expression of P120ctn and eight (47.1%) with cytoplasmic expression, with abnormal expression rate of 47.1. There could be seen normal membranous expression of P120ctn rather than cytoplasmic expression in eight healthy controls. Abnormal expression of P120ctn was associated with capsule integrity, nodal metastasis, satellite focus and tumor cell differentiation (P<0.05), but not with gender, age, tumor size and disease stage (P>0.05). Conclusions In HCC, there exists high rate of abnormal expression of P120ctn, which is mainly reduced membranous expression combined with abnormal cytoplasmic staining. P120ctn can be used as a valuable index for predicting metastasis and prognosis condition of HCC. 【Key words】 P120 catenin; Hepatocellular carcinoma 早期侵袭和转移是肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要特征以及不良预后的关键因素。E钙黏连素(Ecadherin)作为主要的上皮细胞黏附分子，其介导的细胞间黏附在HCC转移的过程中扮演了十分重要的角色。Ecadherin正常黏附功能的维持需要与连环蛋白 (catenin)、 连环蛋白(catenin)、连环蛋白P120(P120 catenin，P120ctn)及细胞骨架形成一个完整的复合体。P120是近期发现的连环蛋白家族成员1，和已被研究颇多的经典连环蛋白(catenin、catenin)相比，其生物学功能了解不多。本研究通过免疫组化法探讨P120ctn表达与HCC临床病理之间的关系。 1 材料与方法 1.1 临床资料 收集2003-2005年手术切除经病理证实为HCC的标本58例，其中男47例，女11例；年龄2869岁。肿瘤分期根据国际抗癌联盟TNM确定，肿瘤分化按照Edmonson分级。肿瘤体积按直径分为2类(<5 cm、5 cm)。所有病例术前均未接受任何放射治疗或化学治疗。对照组17例癌旁肝硬化组织和8例正常肝组织(原发病为肝胆管结石、肝腺瘤等)，经过HE染色病理切片证实无癌变。 张毅，等. 连环蛋白P120在肝细胞癌中的表达及其意义 1.2 主要试剂 鼠抗人P120ctn蛋白单克隆抗体购自BD Clontech；PV9000免疫组化试剂盒、DAB试剂均购自北京中山生物制品公司。 1.3 方法 采用非生物素化辣根酶标记免疫组织化学染色法。操作步骤按试剂盒说明书进行，显微镜下观察染色强度。每次实验均以已知阳性切片为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。 1.4 阳性结果判断 染色评估分别由两位病理医生完成，一致性达95%以上。对染色评估有异议的切片，两位病理医生同时复习求得一致。评估标准参照文献2，每例组织切片随机观察5个高倍(HPFs400)视野，并计数200个肝细胞或肝癌细胞：(1)正常表达：此时细胞呈连续的膜染色，强度与正常肝细胞相同，且膜阳性细胞>90%，而胞质无染色；(2)异常表达：阴性，即膜表达缺失；弱阳性，即膜表达减弱、不连续或膜阳性细胞<90%；胞质表达，即胞质出现棕黄色颗粒。 1.5 统计学处理 采用SPSS 10.0软件对阳性率进行2检验(Fishers exact test)和相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 P120ctn在HCC、癌旁肝硬化组织、正常肝组织中的表达 由表1可见，58例HCC组织中有34例(58.6%)膜表达弱阳性或缺失，30例(51.7%)胞质表达，异常表达总比例为65.5%(38/58)；17例癌旁肝硬化组织中有6例(35.3%)膜表达弱阳性，8例(47.1%)胞质表达，异常表达总比例为47.1%；8例正常肝组织全部表现为胞膜正常表达，无胞质表达。三者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。 2.2 P120ctn的表达与HCC的临床病理特征关系 由表2可见，P120ctn的异常表达与HCC的包膜形成、淋巴浸润、有无卫星灶、肿瘤分化等相关，而与性别、年龄、瘤体积大小、分期等无关。表1 P120ctn在各组织中异常表达情况表2 P120ctn表达与HCC临床病理因素关系 3 讨论 连环蛋白是一组与跨膜黏附分子家族钙黏连素(cadherin)的细胞质结构域密切相关的胞内糖蛋白家族，能与cadherin的胞内肽段及细胞骨架结合，形成一个完整的复合体，共同介导细胞黏附和信号转导功能，在形态学发生和维持组织形态的完整性方面起着重要的作用3。多数与连环蛋白家族结合或有功能联系的蛋白都属于肿瘤相关基因，如Src家族激酶、受体酪氨酸激酶、Wnt1、APC等。 与最早发现的、连环蛋白不同，P120ctn结合在cadherin的胞内肽段近膜端(juxtamembrane domain，JMD)，并不和细胞骨架相连。由于cadherin家族的JMD具有高度保守性，而P120ctn与cadherin又是一种相对松散、可逆的结合关系，提示P120ctn在调控cadherin功能中可能起着重要的作用。已知P120ctn最重要的功能是维持cadherin的数量，P120ctn缺失将会导致膜上cadherin被迅速降解，而且这种调节是蛋白质水平的，P120并不影响cadherin的mRNA水平，只是延长cadherin在膜上的“半衰期”4。 正常情况下，P120ctn与catenin相似，主要分布在细胞膜上。本实验58例HCC组织中有34例(58.6%) P120ctn膜表达弱阳性或缺失，这显然可能导致膜上cadherin数量的减少，从而降低细胞间黏附，促进HCC转移。还有30例(51.7%)出现明显的P120ctn胞质异常分布。已知P120ctn在胞质中可以经RhoA途径的活化而诱导乳腺癌细胞的侵袭活性5，还可以通过其氨基端激活驱动蛋白将Ncadherin转送到细胞膜上，提高Ncadherin的胞膜表达，降低细胞间的黏附6。我们推测，HCC中P120ctn的胞质分布可能也通过类似的机制促进瘤细胞侵袭转移。 P120ctn出现细胞内异常分布可能与其自身磷酸化状态有关。肿瘤细胞的微环境中常高表达EGF、PDGF、CSF1、VEGF、NGF等SRC家族激酶，均能使之磷酸化7。SRC激酶涉及促有丝分裂信号转导过程，因而P120ctn的磷酸化及其异位分布很可能是细胞分裂增殖过程中一个重要的信号途径。此外，近年还发现异位分布的P120ctn可以进入细胞核，与一种核内转录抑制因子Kaiso结合，间接参与Wnt通路中Siamois、wnt11等基因的调控，在脊椎动物胚胎发育的原肠胚形成中起着重要作用8-9。由于Wnt信号通路与肿瘤的发生和转移关系密切，可以推测P120ctn的核内异常分布极有可能参与调控某些癌相关基因。 P120ctn与肿瘤的关系研究方兴未艾，P120ctn的表达及功能状态改变很可能导致细胞黏附与增殖的失调。我们的实验发现HCC中存在较高比例的P120ctn异常表达，主要表现为胞膜表达缺失伴胞质异常染色，且与HCC的浸润和转移关系密切，P120ctn可以作为预测HCC转移潜能和预后状况的有价值的指标。进一步探讨P120ctn异常表达在HCC转移中扮演的角色，比如是否参与某些肿瘤相关基因的调控，对于深入理解HCC转移的分子机制显然具有十分重要的意义。【参考文献】 1 Reynolds A B, Herbert L, Cleveland J L, et al. P120, a novel substrate of protein tyrosine kinase receptors and of p60vsrc, is related to cadherinbinding factors betacatenin, plakoglobin and armadilloJ. Oncogene,1992,7(12):2439-2445.2 Yap A S. The morphogenetic role of cadherin cell adhesion molecules in human cancer: a thematic reviewJ. Cancer Invest,1998,16(4):252-261.3 Kuroiwa K, Konomoto T, Kumazawa J, et al. Cell proliferative activity and expression of cellcell adhesion factors (Ecadherin, alpha, beta, and gammacatenin,and P120) in sarcomatoid renal cell carcinomaJ. J Surg Oncol,2001,77(2):123-131.4 Davis M A, Ireton R C, Reynolds A B. A core function for P120catenin in cadherin turnoverJ. J Cell Bio,2003,163(3):525-534.5 Anastasiadis P Z, Moon S Y, Thoreson M A, et al. Inhibition of RhoA by P120 cateninJ. Nat Cell Biol,2000,2(9):637-644.6 Chen X, Kojima G, Borisy G, et al. P120 catenin associates with kinesin and facilitates the