顺铂诱导体外儿童睾丸卵黄囊瘤细胞凋亡及p53的表达.doc

顺铂诱导体外儿童睾丸卵黄囊瘤细胞凋亡及p53的表达【摘要】 目的:探讨p53在顺铂诱导儿童睾丸卵黄囊瘤细胞凋亡发生过程中的作用机制。方法:通过原代培养儿童睾丸卵黄囊瘤细胞获取实验对象，再用顺铂进行凋亡的诱导，TUNEL法检测凋亡细胞，免疫细胞化学方法检测p53表达的变化。结果:在顺铂作用下，细胞发生圆缩脱壁，凋亡小体形成。凋亡指数随着作用时间延长而增加（P<0.01），p53的表达在早期（12 h）即达到高峰，此后未见持续增强情况。结论:顺铂能够诱导儿童睾丸卵黄囊瘤细胞的凋亡，而p53表达的增强可能是其重要的环节。 【关键词】 儿童 睾丸 卵黄囊瘤 凋亡 顺铂 p53 Abstract: Objective:To investigate the effect of cisplatin on apoptosis and p53 protein expression of children testicular yolk sac tumor,to find out the mechanism of its anticancer action. Methods: By techniques of cell culture in vitro, yolk sac tumor was treated with cisplatin. Then, the apoptosis index was measured with TUNEL technique and p53 protein expressions of the cells were observed with immunocytochemistry staining technique. Results:Under the effect of cisplatin, the round shrinkage of cells took place and the cancer cells desquamated from the wall. The apoptotic body was formed. The apoptosis index was increased with the increasing of the concentration and the prolonging of time. (P0.01）. p53 gene expression has reached the top level in early stage，thereafter，no lasting enhancement was found. Conclusion: Cisplatin can induce the apoptosis of the childrens testicular yolk sac tumor cell, increase the expression of p53 gene protein, and the increasing of the expression of p53 gene may be one of an important mechanisms of cisplatings anticancer action. Key words: children; testicle; yolk sac tumor; apoptosis; cisplatin; p53 儿童生殖细胞肿瘤占小儿睾丸肿瘤的60%75%，其中以卵黄囊瘤最多1。虽然随着现代医学的发展，对卵黄囊瘤的治疗有效率有了很大的提高，但仍有不少病例对化疗药物不敏感，而细胞凋亡的机制与肿瘤的发生发展以及化疗、放疗不敏感有密切关系。本研究采用体外培养、TUNEL及免疫组化等方法分析顺铂对儿童睾丸卵黄囊瘤细胞凋亡和p53基因表达的影响，以揭示顺铂抗卵黄囊瘤的作用机制。 1 材料和方法 1.1 标本来源 患儿，男性，21月龄。因“发现右侧睾丸肿大半个月”入院，于2003年8月行右睾丸切除术，术中取新鲜无坏死组织进行液氮冻存，术中及术后病理诊断均为右睾丸卵黄囊瘤。 1.2 试剂 鼠抗人AFP单抗，鼠抗人p53单克隆抗体，鼠抗人bcl-2单克隆抗体及SP免疫组化试剂均购自北京中山公司。培养液DMEM购自GIBCO公司。胎牛血清FBS购自杭州四季青公司。TUNEL试剂盒为德国默克产品（FragEL DNA Fragmentation Detection Kit，QIA33）。顺铂为齐鲁制药产品。 1.3 原代细胞培养及处理 组织复苏后，用植块法在完全培养液中（DMEM+10%FBS+青霉素100 U/ml+链霉素100 U/ml，调节pH7.27.4）及在37 ，5% CO2条件下进行原代培养，45 d传代。细胞生长期取含浓度1g/ml，2g/ml，4g/ml，8g/ml顺铂的培养液处理，分别作用12 h、24 h、48 h和72 h后终止反应。为了保持一定的贴壁率，选择2g/ml顺铂浓度作细胞爬片，80%乙醇固定细胞。 1.3.1 MTT法：观察顺铂对儿童睾丸卵黄囊瘤细胞生长增殖的影响，方法参照文献。 1.3.2 TUNEL法检测凋亡细胞：TUNEL检测按照说明书进行，归纳如下:切片常规脱腊，以过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性。用末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleot idyl transferase，TDT)介导生物素化的尿苷三磷酸(biotin-dUTP)和DNA断端结合。结合信号以抗生物素蛋白放大，并以二甲氨基偶氮苯(DAB)显色，光镜辨认被标记的细胞核。在显微镜下每组随机取5个不同视野，计算细胞凋亡指数（apoptosis index）=TUNEL阳性细胞数/总细胞数100%。 1.3.3 AFP及p53表达的检测：免疫细胞化学步骤参照SP试剂盒提供的说明书进行，AFP及p53的一抗浓度均为1:100。用Image-pro plus软件进行图像分析。随机选取10个高倍视野，计数免疫组化阳性细胞数及测定阳性细胞的光密度。将两项数据相乘即为所测样本的免疫组化染色的相对定量结果(expression value，OD)。 1.4 统计学处理方法 采用方差分析。 2 结果 2.1 原代细胞形态观察及AFP表达情况 细胞贴壁生长，活细胞为短梭形或多角形，细胞聚集时可呈束状排列，有一定的极向。接触抑制现象消失，细胞生长密集时，可见多层重叠生长现象。AFP染色阳性，表达于胞浆,呈棕黄色；细胞核苏木精复染为淡蓝色（见图1）。 2.2 顺铂对细胞生长增殖的影响 在1、2、4、8g/ml顺铂作用48 h后，OD值分别为(1.7710.084)、(1.3750.034)、(1.0540.063)和(0.6930.355)，梯度明显，不同组间差异有显著性（F=699.65，P=0.000）。 2.3 顺铂对细胞凋亡的影响 在2g/ml顺铂诱导12 h后即可见TUNEL阳性反应，表现为细胞核内见到暗褐色颗粒（凋亡阳性细胞，见图2）,并且随着时间的延长凋亡比率也逐渐增加，各时间段凋亡表达差异有显著性（F=139.39，P0.01），见表1。 2.4 顺铂作用后p53基因表达的变化 对照组细胞未见任何的p53表达，但是在2g/ml顺铂浓度的作用下，在12 h时即可发现p53在细胞核内的极高表达，表现为细胞核内的棕褐色着色（见图3）。但是并未发现随着时间的延长表达强度随之增强F=0.402，P=0.7520.05，提示p53在顺铂诱导前期即被激活，并且与凋亡指数之间存在显著相关性（r=0.387，P=0.006）。（见表1） 3 讨论 自1952年George Gey从人宫颈癌组织中建立了Hela细胞株以来，人癌细胞培养在各种肿瘤的研究中逐步得到广泛应用，在探明癌变机制、临床诊断、药物筛选治疗等领域都具有重大的意义2。但是关于儿童睾丸卵黄囊瘤细胞的培养报道极少，在国内尚属空白。本研究室用植块的方法已经进行了该细胞的原代培养，并从AFP检测等角度对其生物学特性进行了鉴别，可以作为研究对象。 本实验应用TUNEL方法明确了顺铂对睾丸卵黄囊瘤细胞的作用其实是诱导凋亡的作用，并且凋亡指数具有明显的时效性。从对生物大分子的作用及对细胞周期影响的角度认为,顺铂属细胞周期非特异性药物, 为DNA损伤剂，其主要作用于DNA上的鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶,形成DNA单链内或双链间两点的交叉连接，从而破坏大DNA的结构3。因此理论上，顺铂诱导的睾丸卵黄囊瘤细胞的凋亡应该是p53依赖性的，我们的研究结果支持了这一推论。而且我们还发现，在顺铂（2g/ml）诱导细胞后12 h即可看到p53很高的表达。而在对照组中，p53完全是阴性表达。并且在诱导12 h之后随着时间延长，其表达强度并未见逐渐增强，这一点与许多研究结果不完全一致4。但是充分说明了p53在顺铂诱导卵黄囊瘤细胞凋亡过程中的作用，而且可能是在早期即完成p53的启动激活。我们认为这个结果与Milner等5提出的p53构型理论是一致的，在顺铂作用下，DNA受损而处于不利的生长条件，从而诱导产生野生构型的p53，绝大部分位于核内，阻止细胞增殖，停滞于G1期，促使凋亡发生6。 本研究的结果初步证实了p53在顺铂诱导儿童睾丸卵黄囊瘤细胞凋亡过程中的重要作用，为肿瘤治疗学提供理论依据。但是细胞的凋亡调控是多基因多步骤的复杂过程7，有待于我们进行更加深入的研究。【参考文献】 1 Boyle P. Testicular cancer:the challenge for cancer controlJ.Lancet Oncol, 2004,5(1):56-61.2 薛庆善.体外培养的原理与技术M.北京:科学出版社,2001.5-7.3 Sorenson CM, Barry MA, Eastman A. Analysis of events associated wth cell cycle arrest at G2 phase and cell death induced by cisplatinJ.J Natl Cancer Inst,1990,82(9):749-755.4 Lutzker SG, Mathew R, Taller DR. A p53 dose-response rela-tionship for sensitivity to DNA damage in isogenic teratocar-cinoma ellsJ. Oncogene, 2001,20 (23):2982-2986.5 Milner J, Medcalf EA