黏蛋白MUC2、MUC5ACmRNA在分泌性中耳炎大鼠模型的表达.doc

黏蛋白MUC2、MUC5AC mRNA在分泌性中耳炎大鼠模型的表达【摘要】 目的探讨变应性分泌性中耳炎分泌型黏蛋白MUC2、MUC5AC mRNA的表达变化及白三烯受体拮抗剂的抑制作用。方法建立卵白蛋白激发变态反应性中耳炎大鼠模型，实验动物分为对照组6只、实验组6只和干预组7只。采用RTPCR技术分别检测MUC2、MUC5AC mRNA在3组中耳黏膜的表达变化。结果对照组中，MUC2 mRNA在中耳黏膜表达相对值为（0.230.08），MUC5AC mRNA则不表达；实验组表达相对值分别为（0.380.07）和（0.450.06），与对照组比较差别有统计学意义(P<0.01)；干预组可部分抑制黏蛋白的表达，相对值分别为（0.280.07）和（0.290.09），与实验组比较差别有统计学意义(P<0.01)。 结论MUC2、MUC5AC mRNA在变应性中耳炎中表达上调，可被白三烯受体拮抗剂部分抑制。 【关键词】 中耳炎 伴渗出液 黏蛋白类 聚合酶链反应 疾病模型 动物 分泌性中耳炎好发于儿童，约10%的病例可能演变为慢性分泌性中耳炎，其发病与中耳黏膜腺体和杯状细胞的增生有关，这种黏膜高分泌引起的中耳腔出现不易清除的黏液是其主要特征1。黏蛋白是黏液的主要构成成分，是一种高度糖基化的大分子蛋白质，其高表达与中耳炎的发病关系密切。因此，研究黏蛋白在中耳炎中的表达及其调节，对于进一步阐明中耳炎的发病机制及指导临床治疗有重要意义。 1动物和方法 1.1动物采用耳廓反射灵敏、健康清洁级SD大鼠19只，雄性，体质量约200 g 1.2模型的建立和分组实验前，所有大鼠均经耳显微镜检查排除中耳感染。实验动物随机分为3组：对照组6只，实验组6只和干预组7只。参照文献2方法建立变态反应中耳炎动物模型：（1）实验组。10 mg卵清蛋白（ovalbumin, OVA；sigma级）溶于0.8 mL PBS磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L, pH 7.4）+5.14 mg氢氧化铝凝胶佐剂混合后行腹腔注射，每周1次，连续2周，此为全身致敏阶段；2周后予盐酸氯胺酮(100 mg/mL)+地西泮（5 mg/mL）21混合液（3 mL/kg）腹腔注射深度麻醉。仰卧位，在手术显微镜下相当于舌骨水平做一切口，分离舌骨肩胛肌及舌骨胸骨肌，暴露耳泡底壁，无菌技术将含OVA 2 mg的50 L PBS液注入听泡,此为耳内激发阶段。（2）干预组。同实验组步骤造模，激发前2 d开始给予孟鲁司特（杭州默沙东制药有限公司，批号J20030002）30 mg/kg灌服，每天1次。（3）对照组。全身致敏步骤同实验组，激发阶段耳泡内仅注入PBS液。激发前均肌注青霉素预防细菌感染。 1.3方法 1.3.1组织学检查末次激发后48 h，麻醉后先在电耳镜下观察双耳鼓膜情况，而后断头迅速取下双侧听泡。解剖显微镜下观察鼓室内黏膜和积液情况。 1.3.2RNA提取及RTPCR实验 1.3.2.1总RNA提取各组每只大鼠左侧听泡予焦碳酸二乙酯（DEPC）水冲洗2次。采用异硫氰酸胍裂解法提取左侧听泡鼓室黏膜组织总RNA34，即将异硫氰酸胍35 L注入鼓室,轻轻震摇15 s，吸出置于EP管，重复3次；再加入Trizol 1.0 mL吹打混匀，置室温5 min，加入氯仿200 L，激烈震荡15 s，置于室温23 min，4 12 000 r/min离心15 min，将上清水相（约1 mL）移入新的EP管，加入异丙醇0.5 mL，静置10 min，4 12 000 r/min 离心15 min，倾倒弃上清，加75%乙醇 1 mL清洗EP管，吹打混匀，4 7 500 r/min 离心5 min，弃上清，晾干，加DEPC水50 L溶解。分光光度计测量260 nm和280 nm的光密度比值，判断RNA纯度和浓度。 1.3.2.2引物设计及合成由上海博亚生物工程公司合成，RTPCR引物根据GenBank中MUC5AC基因（基因号：U44946）、MUC2基因（基因号：U07615）、GAPDH（基因号：X02231）用DNAMAN 4.0程序设计如下： MUC5AC基因引物序列 上游：5CATAGCCTCCTCTTGTTC 下游：5ATTCCTGTAGCAGTAGTGAG MUC2基因引物序列 上游：5AGATCCCGAAACCATGTC 下游：5GTTCCACATGAGGGAGAGG GAPDH基因引物序列 上游：5GCTGGTGCTGAGTATGTCGT 下游：5GAATGGGAGTTGCTGTTGAA 1.3.2.3RTPCR按照Invitrogen公司一步法RTPCR试剂盒说明书。在冰上依次加入2buffer 12.5 L，总RNA 2.0 L，正向引物 0.5 L，反向引物 0.5 L，ssRT/Taq 酶混合物0.5 L，DEPC水9.0 L，总体积为25 L。在DNA 扩增仪（ PE2400，美国PE公司）上进行RTPCR: 50 30 min合成cDNA，94 2 min预变性并活化Platinum Taq之后，按94 30 s55 30 s72 45 s，进行36个循环的扩增，最后72 延伸7 min。RTPCR产物用1.0% Agrose电泳分离鉴定。 1.3.2.4半定量分析电泳结果经GeneSnap（SynGene, Version 5.00.09）成像后用GeneTools（SynGene, Version 3.00.22）进行半定量分析。以曲线下峰面积作为PCR产物含量，用目的基因与同一标本内参照基因(GAPDH)积分值之比，表示该基因mRNA相对表达水平。 1.4统计学处理数据以xs表示, 采用SPSS 10.0单因素方差分析统计方法。P<0.05为差别有统计学意义。 2结果 2.1耳窥镜检查对照组鼓膜色泽正常，标志清楚，鼓室黏膜基本正常；实验组鼓膜内陷、混浊，有不同程度充血，鼓室黏膜水肿、潮湿，可见少量淡黄色积液；干预组炎症情况较实验组有所减轻。 2.2RTPCR结果将提取的总RNA在生物紫外分光光度仪（Biophotometer，德国Eppendorf公司）下测其光密度（D）值，各样品的D(260 nm)/D(280 nm)均>1.7，表明提取的RNA纯度符合要求，1%琼脂糖凝胶电泳可见明显的18S和28S两条带，表明RNA完整性好。 预期的目的基因MUC2、MUC5AC片段长度分别为 354 bp和403 bp,MUC2在对照组中耳黏膜呈弱表达,实验组表达明显增强,干预组可抑制MUC2的表达，差别有统计学意义。对照组中耳黏膜MUC5AC不表达，实验组表达明显增强，干预组MUC5AC表达减弱，与实验组比较差别有统计学意义（图1，表1）。 M：Marker；a，b，c：实验组、干预组、对照组；Ga，Gb，Gc：GAPDH电泳条带，608 bp；M5a，M5b，M5c：MUC5AC mRNA电泳条带,403 bp；M2a，M2b，M2c：MUC2 mRNA电泳条带,354 bp. 图13组MUC2、MUC5AC mRNA表达电泳图 Fig 1Electrophoretogram of MUC2 and MUC5AC PCR products in 3 model groups福建医科大学学报2007年5月第41卷第3期刘建治等：黏蛋白MUC2、MUC5AC mRNA在分泌性中耳炎大鼠模型的表达 表13组MUC2、MUC5AC PCR产物光密度相对值与对照组比较，:P<0.01；与实验组比较,:P<0.01. 3讨论 目前已发现的黏蛋白基因有18个，这些基因的表达具有组织特异性。根据功能的不同可分为黏膜固有蛋白和分泌型黏蛋白二大类，前者的功能尚不清楚；后者主要包括MUC2、MUC5AC，是中耳黏液的主要成分，其过度表达可导致极度黏稠的分泌物潴留于中耳腔，妨碍了咽鼓管黏纤系统的正常功能，使得分泌物长期滞留，中耳炎症迁延不愈5。对肺炎链球菌、未分类流感杆菌等细菌引起的分泌性中耳炎的研究发现，MUC2、MUC5AC在中耳黏膜中的表达明显上调，参与了分泌性中耳炎的发病67。黏蛋白在其他因素如变应性分泌性中耳炎黏膜中的表达情况也值得深入研究。新近的观点认为，中耳并非免疫豁免器官，在外来抗原的激发下也可产生较强的局部免疫应答。流行病学的调查资料表明，变态反应与分泌性中耳炎关系密切，是分泌性中耳炎发病的重要致病因素或促发因素之一8。 中耳正常功能的维持有赖于中耳黏纤系统的正常运转，该系统的主要成分为分泌性黏蛋白，与管壁内腺体分泌物在管腔表面形成一道屏障，纤毛在其内规律摆动以有效清除各种有害物质及病原体。黏蛋白的过度分泌必将改变黏液毯的理化性质，破坏黏纤系统的正常功能，极度黏稠的分泌物长期在中耳腔滞留，是造成中耳炎迁延不愈的原因。笔者的研究中，对照组中耳黏膜MUC2、MUC5AC mRNA表达极弱或不表达，经卵白蛋白激发引起中耳黏膜变应性炎症后，表达显著上调。表明同感染性炎症一样，分泌型黏蛋白MUC2、MUC5AC也参与了变应性中耳炎的发病。 一些治疗变态反应的药物如甾体类抗炎药和白三烯受体拮抗剂可以抑制黏蛋白的表达和分泌。Liu等的实验发现，白三烯受体拮抗剂普鲁司特呈浓度依赖性地抑制离体致敏豚鼠气管抗原激发诱导的黏液产生9。黄勇等的研究也发现，另一种白三烯受体拮抗剂孟鲁司特可抑制大鼠炎症气管黏蛋白的表达10。这些实验表明，甾体类抗炎药和白三烯受体拮抗剂可通过抑制黏蛋白的表达，从而达到改善和减轻气道炎症的目的。本研究的结果与此类似。白三烯受体拮抗剂是新近开发出来的治疗变态反应的新药，由于副作用少，已广泛应用于儿童支气管哮喘、变应性鼻炎的治疗，取得较好效果。Combs等尝试性地将孟鲁司特应用于治疗一组持续性中耳积液的患儿，中耳积液的清除率在治疗组和对照组分别为58%和16%，具有显著效果11。本研究为白三烯受体拮抗剂应用于儿童变应性分泌性中耳炎的治疗提供实验证据。【参考文献】 1Nell M J,Grote J J. Structural changes in the rat middle ear mucosa due to endotoxin and Eustachian tube obstructionJ. Ear Arch Otorhinolaryngol, 1999,256:167172.2Hardy S M,Heavner S B,White D R, et al. Latephase allergy and eustachian tube dysfunctionJ. Otolaryngol Head Neck Surg, 2001,125(4):339345.3Lin J,Ho S,Shekels L,et al. Mucin gene expression in the rat middle ear: an improved method for RNA harvestJ. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1999,108(8):762768.4Chen Y P,Tong H H,James M A, et al. Detection of mucin gene expression in normal rat middle ear mucosa by reverse transcriptasepolymerase chain reactionJ. Acta Otolaryngol, 2001,121(1):4551.5Takeuchi K,Yagawa M,Ishinaga H,et al. Mucin gene expression in the effusions of otitis media with effusionJ. Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2003,67(1):5358.6Lin J,Tsuboi Y,Pan W, et al. Analysis by cDNA microarrays of altered gene expression in middle ears of rats following pneumococcal infectionJ. Int J Pediar Otorhinolaryngol, 2002,65(3):203211.7Jono H,Xu H,Kai H, et al. Transforming growth factorbetaSmad signaling pathway negatively regulates nontypeable haemophilus influenzaeinduced MUC5AC mucin transcription via mitogenactivated protein kinase phosphatase1depedent inhibition of p38 MAPKJ. J Biol Chem, 2003,278(30):278112781