鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体.doc

鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体 作者 黄仕龙陈安民郭风劲张衣北【关键词】 殖区软骨细胞, 摘要：目的分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞，克隆甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrp）基因并构建真核表达载体pEGFPIRES2PTHrp。方法Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞，用X型胶原抗体和电镜鉴定，提取总RNA，RTPCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA，插入pCR21 TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFPIRES2。结果分离出增殖区软骨细胞，经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体，为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。关键词：PTHrp基因；质粒；殖区软骨细胞；表达载体Identification of epiphyseal proliferating zone cells and construction of eukaryotic expression vector containing PTHrp geneAbstract：ObjectiveTo separates proliferating zone cells from the growth plate,then clone the parathroid hormonerelated peptide gene (PTHrp) and construct its eukaryotic expression vectorMethodAfter centrifugation through a discontinuous Percoll gradient,the third and fourth fractions cell populations of growth plate chondrocytes were identified with anticollagen type X and electron microscope imageThe total RNA was extracted from cells after identification and the full length eDNA encoding PTHrp gene was obtained by RTPCR method and inserted into pCR21 TA cloning vectorAfter the sequencing was confirmed,the gene was subcloned to pEGFPIRES2 to construct recombinant eukaryotic expression vector pEGFPIRES2PTHrpResultThe proliferating zone cells were separated from growth plateEnzyme digestion analysis and sequencing showed that the target gene was cloned into recombinant vectorConclusionThe proliferating zone cells were identified accurately and the eukaryotic expression plasmid containing PTHrp gene was successfully constructed,which may be a promising for studying the biological function of the PTHrp gene and its role in chondrocyte differentiation and bone formationKey words：PTHrp gene; Plasmid;Growth chondrocyte; Expression vector 软骨缺损临床极为常见。软骨受损后自我修复能力极为有限，且对软骨细胞的增殖、分化规律和调控机理缺乏认识，目前对软骨缺损尚无很好的治疗方法。甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)在研究恶性肿瘤高钙血症时被发现，故称为体液恶性肿瘤高钙血症因子(HHM)，因与PTH生物学特性相似，现在称为PTHrp其基因定位于12号染色体短臂。近年来，对PTHrp的功能研究取得了初步进展，但其确切的生物学作用仍不清楚。PTHrp分布较广，在骨骺增殖区细胞中丰度最高。有研究发现PTHrp主要通过自分泌和旁分泌发挥作用，最近研究表明PTHrp是一种重要的发育调节分子，可能通过Ihh信号途径抑制软骨细胞的分化和成熟并刺激其增殖，以延长软骨发育成熟过程，延迟软骨发育，抑制软骨细胞凋亡，从而有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构。由此可见，深入研究PTHrp基因的功能对于阐明软骨骺板分化发育机理以及调节软骨生长都有重要意义。本研究从骨骺增殖区软骨细胞中克隆得到了PTHrp基因，成功构建了真核表达载体，为下一步揭示PTHrp的生物学功能以及其在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定基础。1 材料和方法11 主要材料纯系清洁级SD大鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。111 主要试剂和工具酶载体pEGFPIRES2购自美国lnvitrogen公司，载体pCR21 TA、菌种Ecoli DH5由同济医院矫形外科实验室保存，DMEMF12培养基购自Hyclone公司，胎牛血清、青链霉素、collagenaseP、DNA酶I购自Gibco公司，DNALadder、TrizolReagent、BamHI、EcoRl、TaqDNA合成酶，购自MBI Fermentas公司，T4DNA连接酶购自Promega公司，兔抗鼠anticollagentype X购自Calbiochem公司，PCR clean up kit、NDA Extraction Kit、Plasmid lsolation Kit购自上海华舜公司，SP9000免疫组化试剂盒、ZLI9032浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司。112 引物设计根据GeneBank(NM012636)序列编码区自行设计上下游引物，由上海生工工程公司合成，上游序列为：5CG GAA TTC TGG AGG CGC TGA TTC CTA CA3，下游序列为：5CG GGA TCC AAC GTG TCC TTG GAA GAT CT3。12 方法121 骨骺生长板增殖区软骨细胞的取材参考靳小兵1，Barbara DBoyan等2的方法并做适当改良。无菌分离新生SD大鼠股骨和胫骨，去除软组织，锐性分离骨骺与骨干之间膨大、半透明组织置DMEMF12培养基中，充分剪碎37 孵育过夜。根据Jurgen Weisser等4方法，组织碎片以01胰蛋白酶(HBSS配制)37 温和振荡孵育20 min，DMEMF12洗涤，001胶原酶P 37 温和振荡消化过夜，继以01胶原酶P 37 处理4 h以充分释放细胞。40目筛网过滤、洗涤后以含001DNA酶I的培养基重悬细胞，小心移至预先配置的不连续percoll密度梯度液顶层，400 g离心1 h，取第4层细胞(密度约为1053 gml)观察(图1)、计数后接种于含10FBS、50 gml VitC 的DMEMF12培养基中，5CO2，100湿度，37 培养24 h后换液，以后每72h换液1次，细胞融合至7580传代。取传第4代细胞鉴定(图2)3。122 增殖区软骨细胞的鉴定取第4代细胞，以104ml的密度接种于24孔板，培养35 d，细胞爬片后按SP试剂盒的方法固定、漂洗、破膜，anticollagen type X孵育，DAB显色，常规脱水、透明、封片后观察(图3)。取生长良好的第4代细胞，常规方法制备透射电镜标本(图4)。123 PTHrp基因的克隆取第4代软骨细胞约106数量级，按Trizol Reagent Kit说明书操作，一步法提取增殖区软骨细胞总RNA，测浓度后取约2 g总RNA作为逆转录模板，根据Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第1链，常规50 l PCR反应体系扩增PTHrp基因开放阅读区片断，模板用量1 l。PCR反应条件为：95 预变性5 min，94 变性1 min；62 退火45 s；72 延伸45 s；经30个循环，72 延伸10 min。取5 l反应产物，以12琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定扩增产物。124 克隆载体的构建和序列测定TA克隆载体pCR21与经PCR clean up kit纯化的PCR产物按15(摩尔比)的比例在T4DNA连接酶作用下进行连接，22 反应1 h。连接反应液转化感受态Ecoli DH5细菌，将转化的菌液涂在Xgal处理过的Ampr的LB琼脂糖平板上培养12h，在长出蓝、白克隆的LB平板上挑取白色克隆进行少量扩增、质粒小提，单酶切初步鉴定阳性细菌克隆，将酶切鉴定正确的细菌克隆送交上海生工公司测序。125 PTHrp真核表达载体的构建测序正确的质粒pCR21PTHrp以限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI 37 双酶切2 h。载体pEGFPIRES2同样以BamHI和EcoRI 37 双酶切3 h,使之完全线性化。载体和目的片断均12琼脂糖凝胶电泳，胶回收后根据相应浓度按载体：目的基因摩尔比为110在T4DNA连接酶作用下22 连接1h，反应体系为20 l；连接反应液转化感受态Ecoli DH5菌，涂布于kanr的LB琼脂糖平板筛选，挑取生长良好的细菌克隆于LB培养基中振荡过夜，以High Pure Plasmid Isolation Kit提取质粒。重组质粒进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，体系同上；酶切产物进行琼脂糖电泳并照片。重组质粒命名为pEGFPIRES2-PTHrp。2 结果21 增殖区软骨细胞鉴定percoll梯度离心、重悬后的增殖区软骨细胞直径约7 m，大小均匀，折光性良好(图1)，贴壁后细胞为多角形，与Boyan等描述一致(图2)。增殖区软骨细胞胞浆内有棕黄色颗粒存在，表明胞浆中表达X型胶原，胞核不着色(图3)。电镜下见细胞为球形，胞核形态不规则，核仁边集，可见核小体，细胞内有丰富的粗面内质网(图4)。22 目的片断的扩增从增殖区细胞中提取的总RNA经电泳可得28、18和5s共3条带，测OD260为02 613，OD260OD280为18 645，说明提取的总RNA完整性较好，纯度高，符合RTPCR的要求。PCR产物经电泳可得到约600 bp的特异性条带。与预期大小一致(图5)。23 重组克隆载体pCR21PTHrp的酶切鉴定及测序分析重组克隆载体pCR21PTHrp经单酶切后得到一条600 bp的目的条带和一条约39 kb的线性化质粒pCR21的条带。单酶切鉴定正确的pCR21PTHrp细菌克隆进行测序，测序结果与Gene bank登陆序列进行Blast对比，结果显示碱基序列完全一致。24 重组表达载体的构建由质粒pEGFPIRES2PTHrp进行PCR扩增出600 bp的条带。将pEGFPIRES2PTHrp双酶切后电泳可得与PTHrp大小相同的片断和约53 kb的片断(图6)。说明PTHrp基因已经成功连接到pEGFPIRES2多克隆位点中的BamHI和EcoRI酶切位点之间，重组真核表达载体构建正确。3 讨论PTHrp分布较广泛，在骺板主要由增殖区细胞产生，依靠自分泌及旁分泌作用自我内部调节。在维持骨骺细胞的稳定性方面，局部微环境中存在着一个信号环：Ihh(Indian hedgehog)PTHrp，它们之间的作用与调控，促使骨骺细胞处于一种分化相对稳定的状态。骨骺各阶段不同成熟程度的细胞均表达PTHrp的受体PTHR，但PTHrp主要作用于静止区和增殖区细胞，抑制骨形态蛋白(BMP)的表达，控制它们分化也抑制其凋亡4、5。而静止区细胞可以分泌Ihh的调节PTHrp的表达，从而调控整个骨骺的生长分化。虽然静止区细胞表达PTHR，但离体培养时添加PTHrp并不能产生预想的生物学效应。有报道表明如果将静止区、增殖区细胞共培养，具有不对称分裂特性的静止区细胞则可以在相当长时间内保持干细胞的特性。静止区细胞和增殖区细胞的共生现象的原因尚不清楚，可能同PTHrp在增殖区细胞中表达，而且不仅只起信号分子的作用也参与生长调控，对骨骺干细胞的稳定性起着重要作用有关6。 本实验中分离细胞时，由于不连续percoll密度梯度离心后第3、4层细胞密度差异较小，彻底分离增殖区细胞与肥大前期细胞较困难，故增殖区软骨细胞中可能有极少量肥大前期细胞混杂，图1中个别细胞体积稍大，考虑为肥大前期软骨细胞。本实验在国内首先借鉴淋巴细胞分离方法，采用pecoll法分离骨骺细胞，取得了初步的成功，为本项目的后续研究打下了良好的基础。本实验利用RTPCR技术，在体外大量获得具有编码PTHrp基因全部功能区的基因片段克隆，然后利用限制性内切酶技术将其连接到真核表达载体中，成功构建了pEGFPIRES2PTHrp重组真核表达载体，酶切图谱与预期结果相符，获得了约600 bp大小的目的条带。将目的基因测序结果与Genebank中登录序列进行比对，其余碱基序列完全一致。由于pEGFPIRES2带有一个高效的CMV启动子，大大提高了转录效率，为后续实验中进一步纯化重组蛋白以及在体内的功能性研究中对分泌重组蛋白的定位检测提供了极大的方便。综上所述，本实验成功构建了PTHrp基因的真核表达载体，为更深刻的揭示PTHrp的生物学功能和骨骺细胞分化发育规律，人为调控骨骺干细胞的分化奠定了坚实基础。参考文献：1 靳小兵，罗卓荆，杨柳，等.人胚肋软骨静止区细胞的体外培养及生物学特性研究J.中国矫形外科杂志，2004，4(1)：5759.2Boyan BD,Schwartz Z,Swain LD,et al.Differential expression of phenotype by resting zone and growth region costochondral chondrocytes in vitroJ.Bone,1988,9:185194.3Schwartz Z,Ehland H,Sylvia V.L,et al.1,25dihydroxyvitamin D3 and 24R,25dihydroxyvitamin D3 modulate growth plate chondrocyte physiology via protein kinase Cdependent phosphorylation of extracellular signalr