分子生物学实验报告.doc

南通大学 分子生物学实验报告 系 级班 学号 姓名 目 录实验一 组织和细胞RNA的制备实验二 核酸定量和电泳分析实验三 逆转录反应实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增目的基因实验五 PCR产物的TA克隆（连接）实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备实验七 连接产物的转化及重组子的筛选实验八 质粒DNA的抽提实验九 质粒DNA分子的鉴定及酶切分析 实验一 组织和细胞RNA的制备（一)实验原理：TRIzol法提取组织或细胞总RNATRIzol可以在破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性 。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5106)以及大量的组织(1 g)和细胞(107)均有较好的分离效果。（2） 实验步骤：1.样品处理： 1)培养细胞：收获细胞1-5107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。 2)组织：取50-100mg组织（新鲜或-70及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。2. 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3. 4离心，12000rpm15min，取上清。4. 加入0.5ml异丙醇（或与上清等体积），将管中液体轻 轻混匀，静置10min。5. 4离心，12000rpm10min，弃上清。6. 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4，7500rpm5min，弃上清。7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65促溶10-15min）。注：（一）操作注意事项1. 样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。2. 实验过程必须严格防止RNsae的污染。3. 要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。 （二）RNA实验注意事项RNA实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染，外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 实验二 RNA定量和电泳分析1 RNA定量 (一）实验原理：RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40g/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA（mg/ml）=40OD260读数稀释倍数(n)/1000RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降（2） 实验数据： RNA浓度=1.4mg/ml; OD260=1.93;2. RNA快速电泳1） 快速电泳原理：电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 二）实验步骤：1)RNA电泳所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用清洗剂洗干净后用双蒸水冲洗二遍后在室温晾干备用。2)用新的1TAE 配制1 %琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙锭(EB)直接加入凝胶中。3）制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1TAE , 缓冲液液面淹过胶面。3)点样时,样品RNA 每10l 加入2l 6上样缓冲液，150V电泳10分钟左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA 的质量或进行拍照记录。 三）实验数据：18S28S实验三 逆转录反应（一）实验原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，可为进一步扩增提供模板。（二）实验步骤： 1）取RNase -free的0.5ml微量离心管，冰上依次加入下列试剂的混合物至管中： 5BU-Script buffer 4 l dNTPmix( 10mM ) 1 l Primer 1 l10pmol/l Oligo（dT）18或25pmol/l Random primers 20U/l RNase Inhibitor 1 l200U/l BU-Script Reverse Transcriptase 1 lRNase-free H2O to (12-X) l 充分混匀，短暂离心后置于冰上。2）加总RNA 至以上混合管中：10ng-1g total RNA or 10-500 ng mRNA X l总体积 20 l（注意：RNase Inhibitor应于RNA模板之前加入管中。）3）充分混匀，短暂离心后执行以下步骤：1. 30 10分钟；2. 42 60分钟；3. 99 5分钟；4. 4 5分钟结束后短暂离心收集逆转录产物，-20保存备用。注：实验注意事项1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2.实验中所有物品都应避免RNA酶的污染。操作过程中均应戴手套。实验四 聚合酶链式反应（PCR）体外扩增目的基因（一）实验原理：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。（二）操作步骤1在冰浴中，将以下各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 2xTaq MasterMix 10 l 引物1（10M） 1 l 引物2（10M） 1 l DNA模板（50ng-1g/l） 1 l ddH2O 7 l- 总体积 20 l2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93 30s 56 30s 72 30s，循环30次，最后在72 保温7min。3 结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4 PCR的电泳检测：取5l PCR产物，琼脂糖凝胶电泳检测。（3） 实验数据：2 1注：实验注意事项1. PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。所有试剂都应没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。2. 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。3. PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。4. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。5. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。6. PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。7. 防止DNA的污染：1) 采用DNA酶处理RNA样品。2) 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。 实验五PCR产物的克隆（一）PCR克产物克隆分类及实验原理：1）PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的35外切酶活性和53的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有53校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR产物3端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70或72下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理12小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50100倍。2）PCR产物的TA克隆原理TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中（图4）。 图4 T-A克隆构建示意图（二）操作步骤：1) 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2) 10l体积反应体系如下：取T载体1l (50ng)，加入等摩尔数PCR产物 。加入含ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶合适单位(3U/l，加1l)，用ddH2O 补足至10l 。3) 稍加离心，通常为14-16水浴连接8-14hr，或4过夜。4) 连接产物用于转化感受态细菌。 注：实验注意事项1. 要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2. PCR产物在TA克隆前要通过纯化。3. 在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。4. 不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10、5、2），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备（一）实验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37培养过夜，这样即可得到转化菌落。（二）实验步骤：1. 保存于-70的DH5（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。2. 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。3. 取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）4. 将培养液1.5ml分装入1.5ml离心管中，4离心，4000rpm10min，弃去上清。5. 重复第4步。6. 用冰浴的0.1M MgCl2 0.5ml悬浮30min。7. 4离心，4000rpm10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液100l悬浮。8. -70冻存备用。注：实验注意事项：制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。实验七连接产物的转化及重组子的筛选（一）连接产物转化的原理：转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-, M-)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法、CaCl2 、RbCl 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞( Compenent cells )。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子( Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。（二）实验步骤： 1新鲜制备的或-70下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2加入5m l重组质粒（适量连接产物，一般不超过10l），轻轻混匀。 3冰上放置20分钟。 4于42热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min； 5加200 m l LB培养液，37 250转分振荡培养30分钟。 6室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉100-200 ml上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。 7将培养物适量涂于1%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG）， 8平皿在37下正向放置1小时，待琼脂凝胶表面没有液体流动后，将平皿倒置，培养过夜12-16hr。（一）重组子的筛选实验原理：根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。（1） 实验步骤：1 每组连接反应转化原液取100l用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。2 倒置平板于37继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。3 放于4数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal和ITPG培养基上均为白色菌落。注：实验注意事项1. 连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。2. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。3. 基因重组菌用灭菌甘油保存，建议甘油终浓度8-20%，菌液与甘油充分混匀后-70度保藏。（三）实验数据： 连接产物转化的平皿示蓝白斑实验八 质粒DNA的提取（一） 实验原理：1. 碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。（二）实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)：1将过夜培养的2-4m1细菌，12,000rpm高速离心1分钟，彻底去除上清。(菌液较多时可以多次离心收集菌体)2加入200 m l solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。（注：Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4保存。）3加入250 m l Solution II，立即轻柔上下颠倒离心管5-10次，使细菌裂解，室温放置(2-5分钟左右)至溶液变成澄清。（注：温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。）4加入350 m l Solution III，立即轻柔上下颠倒5-10次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置2分钟。512,000rpm高速离心15分钟。6取出2ml样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。12,000rpm离心1分钟。7取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一支收集管中，吸取700 m l Wash Solution到吸附柱，离心1分钟。8重复步骤7一次。9取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同支收集管中，12,000rpm高速离心2分钟。10将吸附柱放入干净的15m1的离心管中，在柱子膜中央加30-50 m l TE或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温12,000rpm高速离心1分钟。注意：将TE或水预热到50左右可以提高洗脱效率。11 取1-2m l洗脱液做浓度测定，1%琼脂糖凝胶电泳或酶切分析。 实验九 质粒DNA的鉴定和酶切分析一 质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定（一）.实验原理DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样， 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。（二）.实验步骤1、制备1琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。2、胶板的制备 1） 选择适当大小干净的有机玻璃内槽，放好样品梳子。2）将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，加入3-5l 溴化乙锭储存液（2mg/mL）摇匀，缓缓倒入有机玻璃制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。3）待胶凝固后，小心地拔出梳子，将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。4）加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。3、加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。4、电泳1）接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5Vcm。2）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。(四)、实验结果在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)。 M1 1 2 3 M2 图6：质粒酶切图谱 M1 、M2 ：DNA Marker 1 ：载体（上）与插入片段（下） 2 ：线性载体 3 ：超螺旋载体（不含插入片段）二、质粒DNA分子的限制性内切酶消化（一）、实验原理： 限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50l体积1小时内完全切开1g噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说