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基因工程实验,生物化学资料网,实验目录,实验一 实验计划表 实验二 染色体DNA的提取 实验三 PCR扩增 实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接 实验五 感受态细胞的制备 实验六 重组质粒的转化 实验七 质粒的提取 实验八 重组质粒的酶切鉴定,实验一 实验计划表,一、实验目的,、了解本学期整体的实验流程及安排。 、熟练使用微量移液器。 、学习制备琼脂糖凝胶。,生物化学资料网,基因工程（Gene Engineering）又称重组技术，把不同生物的与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。 基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。,二、实验原理,生物化学资料网,凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套 琼脂糖、1TBE、加样缓冲液,三、实验用具及试剂, 目的基因的获取 基因组总提取 凝胶电泳检测 扩增目的基因 产物的电泳检测 产物纯化 获得目的基因,四、实验操作,1.本学期实验计划,生物化学资料网,重组、转化 与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备 转化、平板涂布、培养 筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测,2.微量移液器的使用,将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头,使用操作,生物化学资料网,使用注意事项,未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。 不要横放带有残留液体吸头的移液器 不要用大量程的移液器移取小体积样品 微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。 为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。,生物化学资料网,3. 琼脂糖凝胶制作,选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。 量取25ml 1TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中 称量0.25g 琼脂糖，倒入锥形瓶中 将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化 锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中 等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可,掌握酚氯仿法提取的原理和操作。,一、实验目的,实验二 基因组总提取,生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。,二、实验原理,消化缓冲液: TE 、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶K Tris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇,三、实验用具与试剂,微量移液器、高速离心机、1.5ml管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱,、切取组织 ，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55水浴过夜，获得组织消化液。 、取出消化组织液，5000rpm ，min，取上清液于新离心管 。 、 加等体积ris-平衡酚，轻轻混匀min。 4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管 。 、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀min。 、同。 、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀min。 、同。,四、实验步骤,、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及. 倍体积预冷（）无水乙醇，混匀。 沉淀min。 、12000rpm，15min，弃上清。 、加70%乙醇1ml，混匀。 、 同。 、管放置于烘箱中烘干。 、加ul TE或ddH2O溶解。 、琼脂糖凝胶电泳检测。,提取染色体的基本原理是什么？操作中应该注意什么？,五、思考题,、学习扩增的基本原理。 、掌握技术的常规操作。 、了解扩增的参数设计。,一、实验目的,实验三 扩增,、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异片段的过程。 、反应体系 引物、dNTP、 Mg 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。,二、实验原理,、循环参数 9 5min 9 30s 5 30s 72 30s goto times 72 10min,Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液,三、实验用具与试剂,旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统,、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 dd water 20.5ul 10PCR buffer（不含MgCl2） 3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L Primer 1 1ul 10mol/L primer 2 1ul 模板 1ul Taq酶 0.5ul 总体积 30ul,四、实验步骤,、在离心机中混匀。 、管放入仪中，按照原理中的条件设置程序，进行反应。 、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。,五、思考题,PCR中产生非特异性条带的原因可能有哪些？,实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接,一、实验目的,1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。 2. 掌握DNA体外连接的方法。,二、实验原理,DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关 DNA分子大小 DNA分子构象 琼脂糖凝胶浓度 电泳所用电压 电泳缓冲液,生物化学资料网,2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。 3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯 1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴锅 PCR产物，1TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker,生物化学资料网,1. 2%琼脂糖凝胶电泳 2. 在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量 3. 加入5个凝胶体积量的DR- Buffer 4. 混匀 65加热融化凝胶块 5. 加入DR-Buffer量的1/2 体积的DR- Buffer, 当目的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇 6. 将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm, 1min 弃滤液 7. 加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液 8. 加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液 9. 同8,四、实验步骤,10. 将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测 11. 链接反应（冰上操作） 在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂： 纯化的目的DNA片段 4.5ul Vector 0.5ul 连接液 5ul 混匀 16连接过夜,五、思考题,为什么连接反应的温度要定在16度？,生物化学资料网,实验五 感受态细胞的制备,掌握感受态细胞的制备方法 2. 学习和理解影响细胞感受态的因素,一、实验目的,生物化学资料网,感受态是指受体（或者宿主）细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是有受体菌的遗传性所决定的。转化过程中所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，既不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。用Cacl2处理受体细胞，使细胞的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。,二、 实验原理,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,培养皿，离心管，冷冻高速离心机，超低温冰箱，摇床，锥形瓶 Cacl2， LB Amp-液体培养基， LB Amp-固体培养基，DH5甘油菌,1.先从保存菌种DH52(-70),划线培16h(37) 2.从平板中挑取一个单菌落移到4ml，LB Amp- 培养基中，37摇荡过夜180250rpm 3.按1%的接种量将过夜培养的菌转接于50ml LB Amp-的培养基中，37，250rpm（2h2.5h） 4.当培养菌生长至OD600达0.50.6时（约22.5h），将培养菌取出，在无菌条件下将细菌转移至50ml无菌聚乙烯离心管中，冰浴10min，以使培养液冷至0,四、实验步骤,5.4，5000rpm/min,7min 6.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬于4，5000rpm/min，5min 7.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬冰上放置30min， 于4，5000rpm/min，5min 8.用2ml冰冷Cacl2溶液重悬各管细胞，然后按每管100ul的量分装于预冷的0.5ml EP管中存于-70,生物化学资料网,五、思考题,如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？,生物化学资料网,实验六 重组质粒的转化,一、实验目的,掌握重组质粒的转化方法,生物化学资料网,二、实验原理,1.转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。 2.化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,水浴锅，培养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器，制冰机，牙签 DH5感受态细胞，连接产物，LB Amp-液体培养基， LB Amp+液体培养基，LB Amp+ 培养基平板,1.5ul连接液加100ul感受态细胞（-70取出），置冰上，加后轻轻旋动 2.冰上静置30min 3.42水浴90s热休克，冰上3min 4.加10ul LB （Amp-）至菌液，混匀（颠倒） 5.37烘箱30min 6.37，摇床 30min 180rpm 7.涂平板 100ul/板， 37培养1216h 8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Amp+液体培养基中，37 振荡过夜,四、实验步骤,生物化学资料网,五、思考题,当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB培养基平板前，为什么要在LB培养基中培养1h?,生物化学资料网,实验七 质粒的提取,1.学习质粒DNA提取的基本原理 2.掌握质粒最常用提取方法,一、实验目的,生物化学资料网,二、实验原理,细菌质粒DNA的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量较小、易于复性的特点进行的，碱法是常用的提取方法。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性，从而分离质粒DNA。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,高速离心机、微量移液器、枪头、凝胶电泳系统，凝胶紫外成像系统，EP管 EB，加样缓冲液，阳性克隆的培养液，质粒提取试剂盒,生物化学资料网,四、实验操作,1. 取14ml过夜培养的阳性克隆菌液，12000rpm离心2min,弃上清 2.用250ul的solution(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀 3.加入250ul的solution轻轻上下翻转混合56次使菌体充分裂解，形成透明溶液 4.加入400ul的4 预冷的solution，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，室温静置2min,生物化学资料网,5.室温12000rpm， 10min，取上清 6.将试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上 7.将操作6中的上清液转移至Spin column中12000rpm， 1min，弃滤液 8.将500ul的RinseA加入Spin column中， 12000rpm，30s，弃滤液 9.加700ul的RinseB加入Spin column中， 12000rpm，30s，弃滤液 10.同9,生物化学资料网,11.将Spin column安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜中央处加入60ul灭菌或Elution Buffer,室温静置1min 12. 12000rpm， 1min洗脱DNA 13.凝胶电泳检测提取效果，并以空载体做对照，从质粒大小上初步判断是否有外源基因进入载体,生物化学资料网,五、思考题,在碱法提取质粒DNA操作过程中应该注意哪些问题？,生物化学资料网,实验八 重组质粒的酶切鉴定,1.学习和掌握限制性内切酶的特性 2.了解重组质粒的鉴定方法，重点掌握重组质粒的酶切鉴定方法,一