气相色谱法分离条件的选择.ppt

一、分离方程式,1.分离度(resolution,R)：分离度是指相邻两组分色谱峰保留时间之差与两组分色谱峰的基线宽度总和之半的比值。,R1.5，两组分才能完全分离。,第四节 分离条件的选择,a b c,a:柱效项，b:柱选择性项，c:柱容量项,2.分离方程式,反映分离度与柱效(n),分配系数比()及容量因子(k)的关系式。,理论塔板数,第二组分的容量因子,分配系数比,K、n、对色谱峰的影响 增加k,分离度增加，峰明显变宽； 增加 n,峰变窄，但改善分离度； 增加，增加分离度，峰宽度不变。,二、实验条件的选择,在气相色谱中，固定液、柱温及载气的选择是分离条件选择的3个主要方面。用于提高柱效，降低板高，提高相邻组分的分离度。在进行定量分析时，要求组分能分离完全(R1.5)，才能获得较好的精密度和准确度。 1.从分离方程式选择实验条件：,（一）提高 决定于试样中各组分本身的性质，以及固定相和流动相。,越大，固定液的选择性越好，R越大。 =1，R=0，两组分不可能分离。 提高的方法： 1）改变固定相和流动相的组成和性质； 2）降低柱温,(二)提高k: k大，R大。 k与固定液的用量和分配系数有关，并受柱温的影响。 增加固定液的用量，可增大R ，但会延长分析时间，引起色谱峰展宽。 提高k的措施： 通过改变柱温和流动相组成，将k值控制为210。,(三)提高n,措施： 1）制备一根性能优良的柱子； 2）改变流动相的流速和粘度、吸附在载体上的液膜厚度减小H, 增大R。,2.载气及其流速的选择,范氏方程： H=A+ B/u + Cu a.,分子扩散项为主；采用分子量大的载气如N2，Ar,减小扩散系数，提高柱效。,范氏方程： H=A+ B/u + Cu b.,传质阻力项为主；选用分子量较小的气体，如H2，He,使组分有较大的扩散系数，提高柱效。 通常：u最佳实用u最佳 选择载气还应与检测器相匹配。,3.柱温的选择,柱温是一个重要参数，直接影响分离效能和分析速度。 柱温升高的影响： 1）提高分析速度，缩短分析时间； 2）使气液传质速率加快，可降低塔板高度，改善柱效。 3）高于固定液“最高使用温度”，会造成柱流失。 4)加剧纵向扩散，降低柱效。,优点,缺点,降低柱温的影响： 1）增大分配系数，增加柱选择性； 2）降低气相扩散，减少固定液流失； 3）延长柱寿命，降低检测本底。 缺点： 1）增加分析时间； 2）液相传质阻抗增加，峰扩张，严重时引起拖尾。,3、柱温的选择,选择柱温的原则： 在使难分离的物质得到良好的分离、分析时间适宜、并且峰形不拖尾的前提下，尽可能采用低柱温。 对于宽沸程的混合物，采取程序升温 通常根据试样的沸点选择柱温、固定液用量及载体的种类。,表 根据试样沸点选择柱温等条件,试样沸点范围 柱温 固定液用量 载体种类,气体、气态烃 室温100 2030：100 红色 低沸点试样,100200 150 1020：100 红色,200300 150180 510：100 白色,300450 200250 15：100 白色、玻璃,注：固定液用量为固定液：载体,程序升温：指按预先设定的加热速度对色谱柱分期加热以使混合物中所有的组分均能在最佳温度下获得良好的分离。 程序升温可以是线性的，也可以是非线性的。,图a,恒定柱温Tc=45, 图b,恒定柱温，但Tc=120 图c：为程序升温。,例: 程序升温与恒定柱温分离沸程为225的烷烃与卤代烃9个组分的混合物的差别。,4、柱长和内径的选择,分离度正比于柱长的平方根，即 所以增加柱长对分离有利。但增加柱长会使各组分的保留时间增加，延长分析时间。因此，在满足一定分离度的条件下，应尽可能使用较短的柱子。填充柱柱长24m.,3、柱长和内径的选择,增加色谱柱的内径，可以增加分离的样品量，但纵向扩散路径的增加，会使柱效降低。柱内径46mm.,4、进样时间和进样量,进样时间：进样速度必须很快，因为当进样时间太长时，试样原始宽度将变大，色谱峰半峰宽随之变宽，有时甚至使峰变形。一般地，进样时间应在1s以内。,进样量,进样量： 每根柱子，都有最大允许进样量。 进样量过大，会造成色谱柱超负荷，柱效下降，峰形变宽，保留时间改变。 最大允许进样量，应控制在使峰面积和峰高与进样量呈线性关系的范围内，液体试样一般进样0.10.2l。,五、其它条件,气化室温度： 气化室温度应等于或稍高于样品的沸点，以保证迅速气化。通常高于柱温3050，否则色谱峰展宽，峰高下降。 汽化室温度过高，会导致样品分解,检测器温度：,高于柱温30-50或等于气化室温度 TCD：高于柱温，温度升高灵敏度下降，温度应稳定 FID：100以上，对温度要求不高 ECD：温度对基流和峰高影响很大，但应具体样品具体分析,三、样品预处理,对于一些挥发性或热稳定性很差的物质，需进行预处理，才能用于分离分析。 1.分解法 2.衍生化法：酯化法，硅烷化法,一、毛细管气相色谱法的特点和分类 (一)毛细管气相色谱法的特点 1.分离效能高。 2.柱渗透性好（载气流动阻力小） 3.柱容量小，允许进样量小。一般采用分流进样技术和柱后尾吹。 4.易实现气相色谱-质谱联用。 5.总柱效高。 6.应用范围广。,第五节 毛细管气相色谱法,毛细管柱的内径一般小于1mm,可分为开管型和填充型；常规、小内径、大内径毛细管柱等。 1.填充型毛细管柱 填充毛细管柱：先在玻璃管内松散地 装入载体，拉成毛细管再涂固定液。 微型填充柱:柱径细,载体颗粒细到几 十到几百微米。,(二)毛细管柱的分类,2.开管型毛细管柱,按内壁的状态分： (1)涂壁毛细管柱(wall coated open tubular column,WCOT):固定液涂在毛细管内壁上。 (2)多孔层毛细管柱(porous-layer open tubular column,PLOT):在毛细管内壁上附着一层多孔固体，沉积在毛细管玻璃内表面而制成的。,(3)涂载体开管柱(support coated open tubular column,SCOT):先在毛细管内壁上粘附一层载体，在此载体上再涂以固定液。,按内径分：,(1)常规毛细管柱：内径0.10.3mm,一般0.25mm左右，可以是玻璃毛细管柱，或弹性石英毛细管柱(fused silica open tubular column,FSOT柱)，又称熔融氧化硅开管柱。 (2)小内径毛细管柱(microbore column):内径小于100m,一般为50m的弹性石英毛细管。 (3)大内径毛细管柱：柱内径一般为0.32mm,0.53mm,常用石英柱.,详细表达式：,二、毛细管色谱速率理论和实验 条件的选择,(一)毛细管色谱速率理论方程 Golay 方程式 H = B/u + Cgu + Clu,空心毛细管柱，A=0， Cg: 气相传质项在毛细管柱速率理论方程中较为重要。 纵向扩散项随载气线速增加而下降。 为了降低气相传质项的斜率，增加Dg,常采用高扩散系数和低黏度的氢气作载气。,(二)毛细管色谱操作条件的选择,1.毛细管柱的直径 2.载气的选择 3.液膜厚度,1.毛细管柱的直径,H与柱内径平方r2成正比，uopt与柱内径成反比。 内径以100300m为宜。 快速分析采用细内径、短 毛细管柱进行。,2.载气的选择,常用的载气：N2,H2,He. 根据Golay曲线，多用氢气作载气。,3.液膜厚度,液膜厚度增加会使塔板高度增加，柱效下降。 为了快速分析，常用小柱内径和薄液膜柱，为了增大柱容量，采用大口径和厚液膜柱。,三、毛细管气相色谱结构流程,进样部分有用载气分流放空的控制流路和为检测器提供柱后尾吹气的流路系统,(一)进样系统,毛细管柱与填充柱的比较 毛细管柱 填充柱 内径 1mm 46mm 流速 1ml/min 30ml/min 柱外死体积 影响峰展宽 不影响峰展宽 由于死体积影响毛细管柱的峰展宽，柱后要用尾吹流路系统，进样用分流装置，采用分流进样方式。,1.分流进样,分流进样：进样后，气化室中载气流量较大，气化后，将混合物中较小的部分送进柱子，大部分放空。 如气化室总流速100ml/min, 柱流速1ml/min, 进样时间为1/100 min。 作用： (1)快速进样，起始谱带窄。 (2)控制样品进入色谱柱的量，保证毛细管柱不超载。,2.分流进样器和分流比,分流进样器： 使用玻璃内插套管作为 进样器的气化室，分流 进样使用24mm的玻璃 套管，同时打开分流进 样阀。,分流比：放空的试样量与进入毛细管柱的试样量之比。一般在50：1到500：1之间调节。,分流后，柱后流出的试样组分量少、流速慢。 解决方法：灵敏度高的氢焰检测器，采用尾吹技术。,3.线性分流,样品组分经过分流器分出的一小部分的量进入柱子，它能够代表样品中组分的含量，对一个设计合理的分流器，样品中的每一组分都能准确地分流成相同的比例，而与组分的化学性质、沸点差异以及浓度大小等因素无关。,第六节 定性与定量分析,一、定性分析方法 目的：确定待测试样的组成，判断各色谱峰代表什么组分。 优点：分离分析多种组分的混合物 缺点：未知物定性困难，需用已知纯物质或有关的色谱定性参数定性。,常用定性方法,1.已知物对照法 2.利用相对保留值 3.利用保留指数(retention index)定性 4.官能团分类测定法 5.两谱联用定性,1.已知物对照法,方法： 将已知物和未知物在相同的色谱柱上，以相同的操作条件进行实验，将两张色谱图进行比较，保留时间相同，试样可能含有此已知物组分。,复杂样品定性,已知物增加峰高法：将已知物加到未知试样中混合进样，若待定性组分峰比不加已知物时的峰高相对增加了，则可能含有该已知物的成分。 双柱定性：在两个性质差别较大的柱子上该色谱峰峰高都增大，一般可认定是同一物质。,2.利用相对保留值定性,对于组分简单的已知范围的混合物，在无已知物的情况下，采用此法。 通过引入参比物质，计算相对保留值，克服色谱条件变化导致的定性错误 r1,2的数值决定于组分的性质、柱温与固定液的性质，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况等无关。,方法： 查手册 根据手册的实验条件及所用的标准物进行实验 取规定的标准物加入被测样品中混匀，进样，求r1,2 与手册数据对比定性,3.利用保留指数定性,利用手册上的保留指数对物质进行定性，保持固定液及柱温相同。 保留指数的重复性及准确性均较好(相对 误差1%),是定性的重要方法。 方法： 估计未知物为哪类物质 查手册 根据手册给出的色谱条件进行实验 计算保留指数 与手册数据对照定性,4.官能团分类测定法 把色谱柱的流出物(欲鉴定的组分)，通 进官能团分类试剂中，观察试剂是否反 应(颜色变化或产生沉淀)，判断该组分 含什么官能团或属于哪类化合物。再参 考保留值，便可粗略定性。,5.两谱联用定性 气相色谱作为分离手段，质谱、红外光谱作为鉴定工具。 GC-MS，GC-FTIR,二、定量分析方法,1、色谱定量的依据： 当操作条件一定时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号(峰面积或峰高)成正比。 mi = fi Ai fi为校正因子，与检测器及被测组分性质有关,引入定量校正因子的原因,1.当两个质量相同的不同组分在相同条件下使用同一检测器进行测定时，所得的峰面积却不相同不同物质其fi不同 2.混合物中某一组分的百分含量并不等于该组分的峰面积在各组分峰面积总和中所占的百分率,绝对校正因子(fi)：单位峰面积所代表物质的质量 fi = mi / Ai fi值与组分i质量绝对值成正比，所以称为绝对校正因子。 绝对校正因子的局限性： 1）精确求出fi值比较困难。 2）对fi值没有统一的标准而无法直接应用。,相对校正因子fi: 物质i和标准物质s的绝对校正因子之比。 fi = fi / fs 相对校正因子fi常用相对重量校正因子fg（fw）来表示。,相对校正因子的测定方法,相对校正因子与被测物和标准物以及检测器的类型有关，而与操作条件无关。因此， fi 值可自文献中查出引用。若文献中查不到所需的fi值，也可以自己测定。常用的标准物质，对热导检测器（TCD）是苯，对氢焰检测器（FID）是正庚烷。,2、定量方法： 归一化法 外标法 内标法 内标校正曲线法,2、定量方法归一化法,归一化法通常采用面积归一化法,方法优点 a.简便、准确，定量结果与进样量无关 b.流速、柱温等操作条件变化对结果影响很小。,2、定量方法归一化法,方法缺点： 1)必须所有组分在一个周期内都能流出色谱柱，检测器对它们都能产生信号。 2)不能用于微量杂质的含量测定。,外标法,外标法又称标准曲线法 在一定操作条件下，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的量(或浓度)作校正曲线，求出斜率、截距，而后计算样品的含量。若校正曲线线性好，截距近似为零，可用外标一点法(比较法)定量。,外标一点法：,用一种浓度的i组分的标准溶液，进样一次，或同样体积进样多次，取峰面积平均值，样品溶液在相同条件下进样，测得峰面积，用下式计算含量：,i组分的质量,i组分的峰面积,i组分对照液的质量,i组分对照液的峰面积,方法优点： 操作计算简便，不必用校正因子，不必加内标物，常用于日常分析。 方法缺点： 1）色谱条件（检测器的响应、柱温、流动相的流速（特别是对于气相色谱）、进样量、柱效等）对方法准确度影响极大 2）进样量要求准确,内标法,方法： 选择适宜的纯物质作为内标物，定量加到准确称取的样品中，根据被测组分和内标物在检测器上的响应值之比及内标物的加入量进行定量，此方法称为内标法。 mi=fiAi ms=fsAs,内标物应满足的条件,1. 内标物应是试样中不存在的物质 2.内标物的性质应尽可能与被测组分性质相近，不与样品发生化学反应并完全溶于样品 3.内标物的色谱峰应尽可能位于被测组分的峰附近，或几个被测组分峰中间，并且与这些组分完全分离 4.内标物的加入量应与被测组分相近,方法优点： 1.定量结果准确，不需准确进样； 2.只要内标物及被测组分出峰，与其他组分是否出峰无关； 3.适用于测定药物中微量有效成分或杂质的含量。 方法缺点： 样品配制麻烦，不易寻找内标物。,内标校正曲线法,特殊的内标法以被测组分的纯物质作为内标物的内标法。 方法 配制一系列不同浓度的对照液，并加入相同量的内标物；配制试样液，加入相同量的内标物，进样分析，测Ai和As，以Ai/As对对照溶液浓度作图，求出斜率、截距后，计算试样的浓度。,内标对比法,内标校正曲线法的截距近似为零，可用内标对比法(已知浓度试样对照法)定量：,方法优点： 不必测出校正因子，消除了某些操作条件的影响，不需严格准确体积进样。 方法缺点： 要进行两次色谱操作，必须保证两次测定的校正因子相同，否则会导致测定误差,三、应用及实例,气相色谱法在药物分析中的应