实验10双缩脲法测定蛋白质含量.ppt

实验十 双缩脲法测定 蛋白质浓度,一、实验目的 1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法 2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析,维生素B12溶液的吸收光谱,主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm； 核酸的最大吸收波长为260nm。 （3）比较吸光度的比值 纯DNA：,（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析,1原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=cl 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； 为摩尔消光系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度,2常用方法 （1）标准曲线法 标准曲线与样品的测定条件必须一致。,（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。,微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量,被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。,Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度,蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。（Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。,含有核酸的样品： 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A2800.74A260,总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）,准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝,基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。,Coomassie Dye-Based 蛋白质定量,双缩脲法测定蛋白质* 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围1-10mg H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 双缩脲,三、操作步骤 1.取15支试管，按下表编号、加试剂,2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。 3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。,四、结果处理 1.绘制标准曲线 以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品的计算 根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg/mL），再根据样品的体积算出样品的浓度。 五、注意事项 1. 须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。 2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。 3. 比色杯的使用,微量表达法 10-3 (g, m, L) milligram 毫（克） mg 10-6 microgram 微（克） g 10-9 nanogram 纳（克） ng 10-12 picogram 皮 （克） pg 10-15 femtogram 飞（克） fg 10-18 attogram 阿、渺（克） ag 10-24 zepto（仄普托） 沙（克） zg ppm: parts per million 1 g/ml 1ppm ppb: parts per billion 1 ng/ml 1ppb ppt: parts per trillion 1 pg/ml 1ppt,五、分光光度计的使用 仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式 “100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%T”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长,3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室