《BCA法测蛋白》PPT课件.ppt

1,实验二 BCA法测定蛋白质浓度(BCA protein concentration determination ),耿 磊 生物化学教研室 （301室） 邮箱：,2,注意事项,前 言,实验目的,实验原理,思 考,实验步骤,3,前 言,一、蛋白质的理化性质,？,（一）、蛋白质的胶体性质 （二）、蛋白质的两性电离和等电点 （三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚 （四）、蛋白质的紫外吸收 （五）、蛋白质的呈色反应,4,（一）、蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷、水化膜,5,（二）、蛋白质的两性电离和等电点,蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基 侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电 荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子 的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。,6,（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚,* 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破 坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其 理化性质改变和生物活性的丧失。 * 蛋白质沉淀（precipitation） 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互 缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉 淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此 凝块不易再溶于强酸和强碱中。,7,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（四）、蛋白质的紫外吸收,8,（五）、蛋白质的呈色反应,蛋白质分子中的肽键及氨基酸残基的各种特殊基团，在一定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色的深浅与其浓度成正比。 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 双缩脲反应(biuret reaction) 3.Folin-酚试剂反应,9,二、蛋白质的测定方法,？,（一）紫外线吸收法 （二）双缩脲法 （三）Folin-酚试剂法 （四)考马斯亮蓝结合法 （五）改良微量凯式定氮法 （六）BCA法,10,(一）紫外吸收法,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作 定量测定。 优点：是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 缺点：准确度较差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干扰测定。,11,（二）双缩脲法,H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 双缩脲 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 优点：操作简便、迅速、受蛋白质性质影响较小。 缺点：灵敏度较差，本法测定蛋白质范围1-20mg； 特异性不高,12,蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。 缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。,（三）Folin-酚试剂法,13,考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合， 使染料的最大吸收峰值从465nm变成595nm，溶液的颜色 由棕红色变为蓝色，在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓 度成正比，故可用于蛋白质定量测定。 优点：简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法 灵敏4倍）。 缺点：用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；大量去垢 剂会使显色反应受到干扰；标准曲线有轻微的非线性；比色 杯染色严重，影响重复性。,（四)考马斯亮蓝结合法,14,蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相 当恒定，一般为16%，其他非蛋白质的含氮化合物所占得氮 量甚微。因此，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质含 量。 优点：准确度高，可测定不同形态样品。 缺点：灵敏度低，适用于0.21.0mg氮，误差为2费 时。,（五）改良微量凯式定氮法,15,（六）BCA法,碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成 紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲 线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 优点：操作简便、快速、灵敏度高，准确，试剂稳定性 好，经济实用，抗干扰能力强。,16,BCA蛋白质检测流程：,17,18,19,1.学习 掌握BCA法测定蛋白质浓度的 原理。 2.掌握721型分光光度计的使用。 3.了解蛋白质测定的多种方法，并比较其优缺点。,实验目的,20,实验原理,BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）碱性条件下，蛋白将Cu+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 BCA分子式：,21,原理图：,22,实验步骤,（一）实验材料 1、器材 721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 (1)试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2L，混合。 （4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。 (5)待测样品。,23,（二）操作,24,1、将上述各管混匀后于37C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。 2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L)。,25,注意事项,1、紫外分光光度计的正确使用。 2、试剂的准确量取，按操作表的顺序依次添加试剂。 3、待测样品浓度在502000微克毫升浓度范围内有较好的线性关系。 4、注意安全，保护好仪器。,26,1、试比较BCA法与双缩脲、Lowry法的异同。 2、BCA法常用于科研，其有哪些特点。,思考,27,1）预热仪器。 2）选定波长。 3）固定灵敏度档。一般测量固定在“1”档。 4）调节“0”点。 5）调节T=100。 6）测定。 7）关机。,紫外分光光度计的使用,28,下次实验：