《放射免疫技术》PPT课件.ppt

第七章 放射免疫技术,第一节 放射免疫技术 一、原理及分类 二、常用的放射性核素 三、标记物制备及鉴定 四、抗血清鉴定,第二节 放射免疫分析 一、基本原理 二、实验方法及测定 第三节 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA与RIA的比较,思考题 小结,免疫技术：以抗原-抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。 标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。 标记免疫分析：用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。,标记免疫技术基本概念,常见标记免疫技术,放射免疫技术 酶免疫技术 荧光免疫技术,第一节 放射免疫技术,早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。,放射免疫 RIA 以标记抗原与反 应系统中未标记 抗原竞争结合特 异性抗体来测定 待检样品中抗原 量。,免疫放射 IRMA 以过量标记抗体 与抗原非竞争结 合，采用固相免 疫吸附载体分离 游离和结合标记 抗体。,放射受体分析 RRA 放射配体结合 分析RBA,其它,一、放射免疫技术原理及分类,二、放射免疫技术常用的放射性核素,125I 3H 射线 理化性 活泼 差 核素丰度 90% 半衰期 60.2d 12.3y 标记方法 简单 复杂 标记设备 低廉 昂贵 测量条件 简单 复杂,常用标记核素,125碘-标记物的制备标记,125I-,化学或酶促反应，将 放射性负电碘离子氧 化成碘原子或正电碘 离子，通过取代反应 置换被标记物分子中 酪氨酸或酪胺残基以 及组胺残基上的氢原 子。,125I或125I+,125I-标记物 （混合物）,Ch-T、LPO氧化,取代反应,直接标记法,三、放射免疫技术标记物制备及鉴定,使用无还原剂的高比放射性碘源 被标记物用量要少 ch-T用量要低 控制总反应体积200l 反应时间1-2分钟 弱碱性反应条件,间接标记法,联接标记( bolton-Hunter )预先将125I用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残基反应，从而使待标记物被碘化。,bolton-Hunter,125碘-标记物的制备纯化,凝胶过滤法 离子交换层 析法 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 高效液相色 谱法,聚合、损伤物,标记蛋白,游离125I,125碘-标记物的制备鉴定,标记物质量 高比放射性 高纯度 完整免疫活性,放射化学纯度 单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率 应大于95%,免疫活性 标记物与抗体结合的能力 标记物与过量抗体反应百分比 该值越大, 标记物免疫活性好,比放射 单位化学量标记物中所含的放射性强度 单位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性过高，将影响标记物免疫活性,计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性. 自身置换法 ：比较标记抗 原与标准抗原的免疫活性来 测定标记物的比放射性,结果准，测定复杂,比放射性计算法,结果欠准，计算简便,自身置换曲线 反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原 标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少 两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性,标准曲线 反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成 标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少,比放射性自身置换法,标准曲线与自身置换曲线平行 表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合 的抗原物质总量相同 计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算 为nCi/ml) 计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量 (ng/ml) 以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直 线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng),四、放射免疫技术抗血清鉴定,抗体分子上一个抗原结合部 位与相应的抗原决定簇之间的 结合强度 用亲和常数Ka表示。 单位为稀度单位（LM-1） Ka值高（10912L/mol）有助于提高灵敏度、精确度和准确度,亲和性,亲合力高,亲合力低,放射免疫技术抗血清鉴定,特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力 交叉反应率：将反应的最大结合率抑制下降50% 时特异性抗原与类似物的剂量（ED50）之比 抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性,特异性,效价,五、方法学评价,除了常规的灵敏度、精密度、准确性、 特异性和稳定性之外，应注意以下指标： 可靠性 剂量-反应曲线 高剂量钩状效应,第二节 放射免疫分析,一、放射免疫分析基本原理,竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力,Ab限量，Ag*定量, Ag*和Ag的量大于 Ab结合位点，二者 通过竞争方式与Ab 结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放 射量降低,二者变化 成函数关系。,以未结合的Ag*为 F，Ag*Ab复合物 为B，则B/F或 B/(BF)与Ag的 量变存在着函数 关系剂量反应 曲线,注：T即是B与F的总和,二、放射免疫分析实验方法及测定,抗原抗体反应,Ag*,Ag,反应条件 体积 温度 时间 pH,Ab,(标准Ag/样品Ag),平衡 非平衡 一步法 二步法,分离结合、游离标记物,二抗体沉淀法,PEG 沉淀法,PR 试剂法,活性炭吸附法,分离彻底，迅速 分离试剂和过程不影响反应平衡 效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好 经济,测量、数据处理,晶体闪烁计数器 包括了NaI闪烁晶 体、光电倍增管 以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分 钟计数(cpm),计算,参数 cpm B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%),拟合,注：T即是B与F的总和,第三节 免疫放射分析,一、免疫放射分析基本原理,以过量125I标记抗体与待测抗原进行非竞争 性免疫结合反应, 用固相免疫吸附剂对B或F 进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIA 操作也较RIA简单。,单位点 IRMA,先用过量标记抗体与 待测抗原进行反应，形成 抗原抗体复合物；用固相 抗原结合未结合标记抗体 并将其分离, 测定上清液 的放射量,双位点 IRMA,先用固相抗体与抗原结 合，再用过量的标记 抗体与抗原的另一决定 簇结合，形成固相抗体- 抗原-标记抗体复合物， 洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。,二、IRMA与RIA比较,放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好, 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, RIA将逐渐被取代。,放射免疫分析技术的应用,1.放射免疫技术的核心是什么？ 2.制备放射性125I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？ 3.评价125I标记物质量的指标有哪些？ 4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？ 5.放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？ 6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？ 7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？ 8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？ 9.闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？ 10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？,思考题,放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合，主要包括RIA