产前实验室技术概要.ppt

产前实验室技术,张红国,吉林大学第一医院产前诊断中心 电话E-mail: ,一、产前实验室相关技术,二、唐氏筛查申请单填写注意事项,三、我们实验室开展的项目,产前实验室相关技术,卫生部产前诊断技术管理办法要求：,产前诊断实验室能够开展： 生化免疫；细胞遗传；分子遗传,具体包括： 唐氏筛查 染色体核型分析 羊水细胞培养染色体分析 脐带血染色体核型分析 绒毛染色体核型分析 分子遗传学基因诊断 荧光原位杂交 无创染色体非整倍体产前检测,1、唐氏筛查,可筛查： 唐氏综合征（21-三体综合征） 18-三体综合征 开放性神经管缺陷,（1）实验室检测的母体血清标记物方案， 选择下列任一种： a) 二联法：血清甲胎蛋白（AFP）+血清人绒毛膜促性腺激素游离亚基（Free -HCG ）或者AFP+血清人绒毛膜促性腺激素（HCG） b)三联法：AFP+ Free -HCG+血清游离雌三醇（uE3）或者 AFP+HCG+uE3 或者AFP+ Free -HCG+抑制素A（InH-A） c)四联法： AFP+ Free -HCG+uE3+ InH-A或者AFP+ HCG+uE3+ InH-A,中孕期母血清学产前筛查标准,（2）结果的判别 筛查结果分为高风险和低风险： a)唐氏综合征筛查结果可采用1/270为阳性切割值（临界值），即筛查结果风险率1/270者为高风险妊娠； b)18-三体综合征筛查结果可采用1/350为阳性切割值，筛查结果风险率1/350者为高风险妊娠； c)开放性神经管缺陷宜以母血清AFP 2.0-2.5MOM，为阳性切割值，筛查结果AFP 2.0-2.5MOM者为高风险妊娠。,（3）产前筛查的检出率要求 二联法： T21 60% 假阳性率8% T18 80% 假阳性率5% ONTD 85% 假阳性率5% 三联法： T21 70% 假阳性率5% T18 85% 假阳性率5% ONTD 85% 假阳性率5% 四联法： T21 80% 假阳性率5% T18 85% 假阳性率1% ONTD 85% 假阳性率5%,时间分辨荧光免疫法,时间分辨荧光免疫测定：是一种非同位素免疫分析技术。用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨。 特异性好。 发光时间长。 由于蛋白质等本底物质所发出的荧光发光时间较短，因此可以通过延长时间去除本底干扰，提高准确性。 稳定。,抽母体外周血，检测AFP、 -hCG、uE3，结合孕妇年龄、 孕周、等信息，评估孕唐氏儿 的风险值。 时间分辨荧光免疫分析仪、 三联筛查 假阳性率小于5%时， 检出率70%,（4）我院的检测方法,筛查出的高风险孕妇需要进一步诊断。 21-三体高风险 18-三体高风险 羊水穿刺 染色体核型分析 NTD高风险 超声诊断,2、细胞遗传学检查,染色体检查、染色体核型分析,取样方法,绒毛穿刺取样 羊膜腔穿刺取样 脐带血穿刺取样 外周血取样,产前诊断,有自然流产史、死胎、葡萄胎、女性原发不孕、继发不孕的夫妇； 生过遗传病患儿及先天畸形患儿的父母； 男性少精、弱精、畸精、死精症及婚后不明原因不育的夫妇； 两性畸形及性器官发育异常的患者； 原发闭经、继发闭经的妇女； 染色体异常的患者及患者的父母和同胞；,染色体检查适应证：,原因不明的智力低下及生长发育迟缓的患者； 本人及家系成员患有某种遗传疾病或先天畸形的患者； 未婚青年的相恋对方或其家属患有某种遗传病或先天畸形的患者； 长期接触不良环境因素的婚龄、育龄的男女青年； 常规检查或常见遗传病筛查发现异常者； 青年男女的婚（孕）前检查与咨询。,A：正常二倍体细胞核内 有2 个21号染色体信号 B：21-三体患者细胞核内有3个 21号染色体信号,3、荧光原位杂交 以21号染色体的相应片段序列作探针，进行原位杂交，可快速、准确进行诊断。 21-三体综合征患儿的细胞中呈现3个21号染色体的荧光信号。,FISH具有其不可比拟的优点： 1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年。 2.方法敏感，能迅速得到结果。 3.在同一标本上，可同时杂交几种不同探针。 4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研究， 而且还可用于静止期细胞的染色体数量及基因改变的研究。,目前羊水FISH产前诊断： 可快速诊断胎儿13、18、21、X、Y染色体数目的异常。,4、无创染色体非整倍体产前检测,母体外周血含有的cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养层细胞 怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在 母体外周血中的cffDNA含量在5%-50%之间。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高,无创：10ml外周血，无须空腹 风险小：无流产、感染风险 孕12周以上即可检测 DNA水平检测，准确率99%以上 检测周期短，10个工作日出检测结果,无创DNA产前检测技术与传统诊断技术相比具有如下优势：,嵌合体和多胎目前不能检 影响因素：,孕妇染色体异常 孕妇近期接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗 胎儿其他染色体异常 样本自然溶血或因个体差异造成的cffDNA含量过低 孕周计算不准确 抽血时孕妇体重超过100kg,局限性和风险：,一、产前实验室相关技术,二、唐氏筛查申请单填写注意事项,三、我们实验室开展的项目,唐氏筛查申请单填写项目,中孕期唐氏综合征血清学筛查检测的孕周范围为15-20周6天，早孕期唐氏筛查检测的孕周范围为9-13周6天。请开单医生严格把关。 孕妇的电话号码一定要如实填写，以便核实信息、高风险通知和日后随访。 采血日期应填写采血当日日期（公历）。 出生日期应为孕妇的实际出生日期（公历）。如农历生日应换算成公历后再填写或在申请单上清晰标注。,体重单位为公斤，填写时需注意。唐氏筛查风险评估软件中体重的检测范围为40-120公斤，如不在此范围内，将按最接近的临界值计算（如孕妇体重为38公斤，软件将按40公斤计算），因此在采样时须告知孕妇，得到知情同意后方可送检，并在申请单上标注。 体重可以对孕妇血清中AFP， free-hCG，uE3三个指标进行校正，以避免因体重的增加，使其在血液中浓度降低。 唐氏筛查的风险评估软件默认规则的月经周期为28-30天，超出此范围均为不规则，不能应用末次月经来推算孕周，因此必须提供一份超声信息。 单双胎必须填写。因为如为双胎，血清学指标会较单胎时偏，因此高风险评估软件会对结果进行校正。（从2013年4月7日开始，我中心不再对双胎做中期筛查）,怀孕方式应注明自然怀孕或辅助生殖，如为IVF，应填写取卵日期和植入日期，并提供超声信息。软件同样会进行校正。 每一位受检孕妇均应提供一份超声信息，超声信息以孕早期超声头臀长（CRL）为最佳，如没有孕早期超声，至少应提供一份包括胎儿双顶径数值（BPD）或超声当日提示孕周，二者至少应有一项的超声结果，并注明超声日期。 怀孕过程中是否有阴道流血的现象应如实填写，请开单医生在问诊时注意。 异常妊娠史主要包括不明原因流产、死胎等现象。如孕妇曾生育过21-三体综合征、18-三体综合征，应直接建议孕妇做产前诊断，不建议做唐氏筛查。如孕妇特别要求，应交代清楚后再送检，并在申请单上标注清楚。,胰岛素依赖型糖尿病及吸烟史应如实填写，且为必填项目。 因为有胰岛素依赖型糖尿病病史的孕妇血清中hAFP 低10%；uE3 低7%；free hCGb 低11%。而吸烟的孕妇血清中free-hCG较正常孕妇降低3%，AFP较正常升高3%。 “中孕期母血清学产前筛查知情同意书”应按照知情选择、孕妇自愿的原则，医务人员应事先告知孕妇或其家属产前筛查的性质，孕妇及医生同时签字，不可由他人代签。 年龄在35岁及35岁以上的孕妇，建议直接做遗传咨询。,一、产前实验室相关技术,二、唐氏筛查申请单填写注意事项,三、我们实验室开展的项目,早孕期唐氏筛查 中孕期唐氏筛查 羊水细胞培养染色体产前诊断 脐带血细胞培养染色体产前诊断 外周血染色体核型分析 羊水荧光原位杂交（FISH）产前诊断 流产绒毛组织荧光原位杂交（FISH） 先天性心脏病FISH产前诊断,开展项目,早孕期筛查： （1）血清学筛查，是在孕9-13周6天进行，抽血检测孕妇血清中生化指标（PAPP-A和Free- hCG），结合孕妇的年龄、体重、孕周等进行综合风险评估，得出胎儿患21-三体、18-三体综合征的风险。 （2）一站式筛查，是在孕11周-13周6天做超声NT扫描，确定孕周在11周-13周6天内，然后抽血进行早孕期血清学指标检测，将NT指标与血清学指标、孕妇年龄、体重、采血日期等进行结合，评估胎儿罹患21-三体、18-三体的风险。,早孕期筛查的优势： （1）早孕期筛查把产前筛查的孕周窗提前，使孕妇更早掌握胎儿罹患21-三体、18-三体的风险，尽早进行相关产前诊断。 （2）早孕期筛查还可以与中孕期筛查进行整合，提高21-三体、18-三体的检出率。,流产绒毛组织FISH快速检测,发生率：50%以上的早期流产是由胚胎染色体异常引起，且大多数为染色体数目异常。 原理：FISH快速检测使用13、16、18、21、22、X、Y探针，检测7个染色体的非整倍体。 检测：取流产绒毛组织少许，浸泡生理盐水中送到产前诊断中心4楼前台，进行荧光原位杂交检测。,先天性心脏病FISH产前诊断,发生率：活产婴儿中占8，每年新增15-20万例。 原因：遗传因素心脏调节基因的遗传突变。 环境因素药物、感染、母亲患病等。 检测： 妊娠11-14周进行B超检查，测量胎儿颈背透明带厚度。 中期18-22周用胎儿超声心动图检测。 22q11荧光原位杂交检测。,22q11荧光原位杂交检测,合作开展项目,1、无创染色体非整倍体产前检测项目 2、Array-CGH技术项目 3、单基因遗传病检测项目,1.无创染色体非整倍体产前检测,可筛查13、18、21染色体三倍体 （发报告） 还可观测到其他染色体的非整倍体异常（口头通知） 检出率可达99% 有专家建议： 可以代替产前筛查的精密筛查项目 提示：可供孕妇及其家属选择，但费用高。,2. Array-CGH技术,Array-CGH技术 应用于羊水细胞检测，是一种产前诊断技术。,Array-CGH技术原理与流程,