对虾养殖生物学03(生殖营养学).ppt

四、生殖营养学,1卵巢成熟和产卵后干物质和脂类含量 1） 南美白对虾卵巢成熟过程中，成熟系数增加了8倍，干物质含量由19.4%增至31.0%。无节幼体的干物质含量为18.8 0.2%。在达到完全成熟之前，日本对虾和斑节对虾等养殖虾类卵巢中的总脂类和干物质含量持续增长，而南美白对虾卵巢中的干物质和成熟系数在3天之内就迅速增加，甚至每天每个卵巢增加干重0.5克之多。 2）随着性腺发育，中肠腺中的总脂类含量下降，但其下降却不始于性腺成熟初期。在中肠腺的脂类耗尽之前，卵巢既积累了脂类，这与以前认为中肠腺是脂类贮藏和加工的主要器官有所不同，表明卵巢中的某些脂类可能还来自虾体的其它部位。 3）产后亲虾卵巢中总脂类含量明显减少，表明脂类转移到了后代。无节幼体的总脂量高于发育成熟的卵巢。,2. 卵巢成熟期间和产后的脂肪酸组成,1）中肠腺中的主要脂肪酸为16：0，16：1n-7, 18:0, 18:1n-7, 18:1n-9, 20:4n-6(ARA), 20:5n-3 (EPA)和22:6n-3(DHA), 其中n-3HUFA约占20%，n-3FA为n-6FA的2倍, 且在卵巢成熟过程中变化很小。从1期至4期，中肠腺中15：0和17：0的含量降低，饱和脂肪酸（SFA）的比例和PUFA及n-3HUFA的总量比较恒定。只有单不饱和脂肪酸（MUFA）的总量在4期时高于0期；DHA/EPA之比由1期到2期下降；产后n-3系列FA及其与DHA的比例减少。 2）卵巢和无节幼体中脂肪酸的组成与中肠腺相似，即n-3 HU FA的含量和n-3/n-6比例较高。但卵巢中n-3/n-6比中肠腺高，且性成熟期间卵巢中许多脂肪酸的含量变化显著：14：0和16：0中度增加，15：00有多有少；SFA的总比例不变；16：1n-7增加，18：1n-7波动，18:1n-9减少；MUFA和22：n-6增加，而ARA减少，22：5n-6波动；随着性成熟n-6FA减少，导致PUFA总比例下降；n-3FA和n-3HUFA总量不变。产后亲虾脂肪酸组成没有显著变化，无节幼体的脂肪酸组成与成熟卵相同。,3. 卵巢成熟期间和产后维生素的含量,1）成熟期间，维生素C的含量无显著差异，产后降低。无节幼体内维生素C的含量类似于产后亲虾卵巢。 2) 卵巢和无节幼体中的-生育酚含量高于-生育酚。卵巢刚成熟时，这两种维生素E的含量高，至2期，-生育酚仍持续增加，产后二者显著降低，无节幼体时二者的浓度又增加，其中-生育酚的含量约为4期卵巢的3倍。 未成熟、正在成熟和已成熟的卵巢中维生素C的含量均很高。产后亲虾卵巢和无节幼体内维生素C的含量比成熟卵巢低2倍，表明维生素C被发育的卵和无节幼体所利用。 对厄瓜多尔沿岸野生10日龄南美白对虾仔虾脂肪酸组成的长年观测表明，其20：5n-3、22:6n-3、16:0、16:1、18:0含量和DHA/EPA比高于用浮游植物和卤虫无节幼体饲养的同龄仔虾，而18:3n-3、20:4n-6、18:2n-6、18:1含量则低于养殖仔虾；低温季节不饱和脂肪酸的比例高些，高温季节时，饱和脂肪酸含量高。虽然有人推测，对虾有一定将18碳脂肪酸转化为20和22碳长链脂肪酸的能力，但这种能力很有限，难以满足对DHA和EPA的需要。因此，提供适宜比例（0.8-1.2）和数量的DHA和EPA是对虾育苗的关键技术之一。,卵巢成熟期间脂类和蛋白质代谢动力学,饲料中的三酰甘油酯和磷酸甘油酯在肝胰脏分泌的非胆固醇乳化剂和脂酶的作用下，于前肠内水解，分解成小分子肽和游离氨基酸，立即为中肠细胞所吸收。吸收的游离脂肪酸和甘油酯转化成磷酸甘油酯，作为高密度脂蛋白的成分输入血淋巴（餐后16小时）。 大部分单酰甘油酯、溶血磷酸甘油酯、游离脂肪酸、类胡萝卜素和糖等随消化液进入肝胰脏腔，为R-细胞吸收。某些饲料蛋白和氨基酸也可被R-细胞吸收，大部分为F-细胞所吸收。肝胰脏中的脂肪酸也可以高密度脂蛋白中主要脂类-磷酸甘油酯的形式输入到血淋巴中（餐后1224小时）。通常输出的脂肪酸和蛋白质主要有两种来源。 性成熟期间，肝胰脏中的某些R-细胞特化成卵黄发生细胞（R-细胞的结构和作用见本章第四节），主要合成卵黄蛋白卵黄磷蛋白。卵黄磷蛋白与多不饱和磷酸甘油酯结合。脂动员成高密度脂蛋白后由肝胰脏输出，使肝胰脏中总脂、蛋白和糖原含量减少，血淋巴中磷酸甘油酯增加。,卵巢成熟期间脂类和蛋白质代谢动力学,五、对虾的免疫系统,进化： 单细胞原生动物的吞噬、销毁和排斥异物作用， 环节动物、软体动物和节肢动物，其体腔液或淋巴液内生成血凝素、溶血素和杀菌物质等，皆可非特异性地杀灭病原，清除有害物质，但无特异性抗体反应。 原索动物产生了特有的脊索、咽鳃裂、背管状神经索、淋巴小结及分化的白细胞（初级淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等）。七鳃鳗和八目鳗只具有原始的不完全的胸腺、不完善的淋巴结和由T细胞引起的异体移植排斥反应和B细胞产生少量IgM类抗体。 软骨鱼类和硬骨鱼类，胸腺和脾发育较完全，生成初级分化的T细胞和B细胞，具有一定的免疫记忆。两栖类和爬行类胸腺分化出皮质与髓质，生成典型的淋巴结，T细胞和B细胞完全分化，具有特异性细胞免疫和体液免疫，可产生IgM和IgG两类抗体，T细胞还有了亚群的分化。鸟类有腔上囊淋巴组织，抗体增至IgM、IgG和IgA三类。到哺乳动物抗体已达IgM、IgD、IgG、IgA和IgE五种，由T细胞、B细胞产生，分化成各亚群和免疫活性因子，并与单核巨噬细胞系、正常体液的防护因子联合作用形成完整、协调的免疫防御系统。,虾蟹：,组成：免疫功能的器官（甲壳、鳃、血窦、淋巴等）、组织、细胞、免疫效 应分子及相关。由血细胞及存在于或从血细胞释放到血浆中的多种因 子的活性产生. 体液免疫 分类： 为原始的非特异性的半免疫性防御系统 细胞免疫 体液免疫由起防御作用的分子组成，而不涉及细胞，尽管有些分子源 于并储存于血细胞中。 细胞免疫则由血细胞直接参与。 特点：体液和血液混在一起的开放式循环系统，没有血红细胞，但有白细胞 的类似物（通常称为血细胞hemocyte）。 颗粒细胞（granular cell, GC） 白细胞的类似物 半颗粒细胞（semi-granular cell, SGC） 透明细胞（hyaline cell） 颗粒中含有许多种具有免疫活性的蛋白分子.,非特异性免疫,细胞免疫:由血细胞及存在于或从血细胞释 放到血浆中的多种因子的活性产 生。细胞为防御外来微生物侵袭的主要屏障。 体腔免疫：主要指酚氧化酶原系统的激活、凝集素的凝集 作用和产生抗菌肽、溶菌酶以及溶血素等免疫因 子。 特点：血细胞既是细胞免疫的承担者，又是体液免疫因子 的提供者；体腔免疫因子可以在血细胞中合成并释 放，细胞免疫又受体液因子的介导和影响。,新发现的免疫因子：,1. 对虾抗菌肽（penaeidins）：血细胞内合成 2. 血蓝蛋白：广谱抗真菌，补充penaeidins 3. 抗微生物肽：1类抗微生物肽(astacidin 1); 对虾的阴离子 抗微生物肽（可能是血蓝蛋白的裂解片段） 4. 免疫相关因子：抗脂多糖因子（anti-lipopolysacharide factor）、丝蛋白酶抑制因子(serine protease inhibitor)、 penaeidins、11.5 kD 抗菌蛋白 （antimicrobial protein）、抗酚氧化酶 (prophenoloxidasete)、热休克蛋白70（Hsp-70）和热休克 蛋白90 （Hsp-90）。 热休克蛋白(heat shock protein)：保守的蛋白分子家族管家蛋白(house-keeping protein)、媒人蛋白(matchmarker protein)、分子伴侣(molecular chaperone)。环境与病害严重加剧了对热休克蛋白的研究。 半免疫反应：活下来的病虾能产生抗病毒力黄海1号等的选育。,中国对虾甲壳结构和鳃的结构,(a)头胸甲甲壳 （横切）； (b)头胸甲甲壳 层（横切）； (c)枝鳃横切； (d)鳃丝纵切； (e)鳃过滤碳素 颗粒； (f)鳃血窦。,中国对虾的淋巴器官,1.肠；2.肝胰赃；3.淋巴器；4.胃后腔；5.胃前腔。,中国对虾淋巴器官的组织和细胞,(a)淋巴器官的输入淋巴管，示周细胞和膜下血窦； (b)淋巴器官的实质部分及连接肝胰脏的输出淋巴管； (c)充填小管间的血窦； (d) 淋巴器官的实质及深入实质中的小梁； (e)淋巴器官的被膜和实质中的小管； (f)正在分裂中的淋巴细胞。,中国对虾淋巴器官的组织和细胞,(a)在毛细小管中循环的血细胞；(b)血窦中的血细胞；(c)心脏中的血细胞（常规染色）；(d)心脏组织经H.E.染色示血细胞；(e)吉萨姆染色的血细胞；(f)吞噬碳素颗粒的心脏血细胞。,对虾防御和免疫机理,一、甲壳的机械屏障作用 二、滤过作用 滤集在鳃、血窦和淋巴器官中，防止其扩散。携带异物的血淋巴经鳃管入鳃轴，再经二级血管进入二叉分枝的鳃丝中，异物被滤在鳃血窦和鳃丝末端膨大的囊状结构中。在正常情况下，这些囊状结构是空的，没有血细胞游走；有异物存在时，鳃腔中的血细胞游走到顶端结构中进行吞噬作用，清除异物，或到蜕皮时一同蜕掉。定期检查鳃腔中血细胞数量可监测病害的发生。 三、甲壳动物对异物的识别 四、细胞调节的防御反应,对虾血细胞吞噬过程示意图,与病原接触初期经氧化杀死的主要反应,与病原接触 凝集素 激活NAD（P）H-氧化酶 耗氧增加 超氧化物酶、羟基自由基、单线态氧和过氧化氢 直接 过氧化物酶 + Halides 与几种溶酶体酶协同作用 hypohalides和halidamine 杀死,细胞调节的防御反应,1防御准备 细胞防御作用包括吞噬、包囊和结节形成等过程。吞噬又包括附着、吞入和摧毁三个过程；包囊是细胞层包围外来物的过程，通常出现在寄生物过大，吞噬过程难以吞入的情况下；结节形成类似于胶囊生成（capsule formation），发生在侵入的细菌数量太多的时候。节肢动物的包囊和结节总是黑色的。 对虾没有针对特殊表位的免疫反应即免疫球蛋白，但有识别外来微生物的球蛋白，如脂多糖和-1，3葡聚糖结合蛋白（GBP）等，能识别进入体内的真菌糖。GBP结合了葡聚糖（如海带多糖）后能增强酚氧化酶原（proPO）系统的作用，放大吞噬等作用。 2杀灭和消除外来物 吞噬细胞、血细胞和淋巴细胞在病原体等异物刺激下，伸出伪足形成吞噬体，再与含有大量水解酶类的溶酶体融合形成吞噬溶酶体。溶酶体内的酶和活性氧可杀死并分解病原体。与病原接触激活了寄主的NAD（P）H-氧化酶，增加了耗氧，产生了超氧化物酶、羟基自由基、单线态氧和过氧化氢。这些短周期化合物直接毒害病原，与过氧化物酶产生的hypohalides和halidamine协力，即与几种溶酶体酶发挥协同作用。 3血细胞和肝胰脏RNA的免疫基因文库,影响对虾免疫反应的因子,虾病的发生,世界不同地区对虾的主要疾病,虾病的诊断,1血液学和临床化学 包括；血细胞数、凝血时间、血液中葡萄糖、氮、氨、血清谷-草转氨酶、碱性磷酸酶和血液总量等血液指标也是对虾和龙虾传染性疾病的重要指标，但只有血淋巴凝固时间和血球数量变化可用于虾病诊断。 2组织培养 组织培养法是鉴定有鳍鱼类大多数病毒的主要方法，目前已知至少有5种病毒活细胞。许多甲壳动物（对虾、蟹、龙虾）研究者试图研制细胞株，通过组织培养来鉴别对虾病毒，虽然有些报道声称获得了成功8，但目前尚未应用到对虾病毒的诊断中。 3毒力学分析方法 对虾的非传染性疾病可用毒理学分析方法来诊断。例如，中毒性病症可根据特殊病理的组织斑块来确疹：蓝藻中毒引起血细胞性肠炎（中肠出现炎症斑）；农用杀霉菌剂（benomyl）中毒时肝胰脏中出现特殊的瘀点；黄曲霉毒素病和某些黑鳃和黑壳病也具有特殊的组织症状；残饵和排泄物污染使酚氧化酶、SOD和溶菌酶活力下降9；肌肉痉挛、软壳、胡萝卜素缺乏、维生素C缺乏症等都具有特殊的组织学症状，要依病史和检查结果来确诊。 4血清学方法 血清学诊断已用于对虾病原的诊断。目前已研制出几种弧菌和病毒的单克隆（MAB）和多克隆抗体（PAB）来诊断对虾病原。如创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和哈氏弧菌（V. harveyi）的酶标记免疫吸附测定法（ELISA）；解藻朊酸弧菌（V. alginolyticus）、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、创伤弧菌和哈氏弧菌的单克隆抗体；日本对虾中肠腺坏死状病毒（BMN）的荧光对氨基苯甲酸检测（PAB）；对虾杆状病毒（BP）的ELISA法。目前正在完善IHHNV、HPV、YHA、BP和WSSV的单克隆抗体，解决ELISA中免疫球蛋白（IGM）Mab与正常组织成分的非特异性反应问题，以提高诊断准确性。,虾病的诊断,5分子方法 第一代IHHNV基因探针是从患病的南美白对虾IHHNV中提纯ssDNA，将其“正”和“负”链分配成dsDNA，再把dsDNA的“纯端”拉长成载体PUC18，最后在大肠埃希氏杆菌（E. coli）-DH-5细胞中克隆而成。从已克隆的IHHNV DNA片段文库中选出了5个2.0 Kbp或更大一些的DNA克隆进一步研究。它们分别称为BS4.5、 BG45、 BA401、BA402和DR22，这其中的4个分别含有2.3, 2.0, 3.2和2.2 kbp插入片段。按照其限制酶谱组装在一起，这5个克隆约相当于95% 4.1kbIHHNV的ssDNA基因组。 设备先进的实验室曾用放射标记的基因探针来诊断对虾病原，后来用非放射性的Genius TMI试剂盒基因探针诊断对虾病毒病。这种探针含有异羟洋地黄酶苷元-11dUTP（DIG）作DNA标记物，最终用ELISA系统检测，制造出了IHHNV的非放射性DIG基因探针诊断盒，商品名为ShrimpProbes by Diag X-otics (Wilton, C.T. USA)。 6形态与生态结合法 IHHNV是目前已知最小的对虾病毒，而且东、西半球的差异较大。对虾杆状病毒（BP）的大小介于IHHNV和WSSV之间，且在南美洲自北向南、在美国自西向东减小，很可能有2或3个品系。,几种主要对虾病毒的形态比较,病毒细胞受体相互作用的机理及其应用,1病毒细胞受体的相互作用启动病毒感染周期 病毒感染指病毒进入有机体后繁殖时，有机体与病毒相互作用所产生的各种现象的总和，包括急性病毒感染和持续型病毒感染。前者病程病毒与受体吸附短，短时间内才能分离到病毒，可引起显性和非显性临床症状，