双向电泳的样品制备.ppt

双向电泳的 技术流程和样品制备,Bio-Rad,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,蛋白质组研究的基本技术路线,蛋白质样品的制备,双向电泳,图像分析,转印至膜上的蛋白,凝胶中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白质质量,N端测序,肽序列质谱数据,肽指纹图,数据搜索,新的或已知蛋白,蛋白转录后修饰的鉴定,蛋白质分析技术之蛋白质组学之 蛋白质组表达模式的鉴定技术,1、图像分析技术,2、与质谱相关的技术：,质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程,样品制备,与IPG胶条水和,IPG电泳,与上样缓冲液浸润,SDS-PAGE,转PVDF膜,胶内直接染色,染色,取出蛋白点,胰酶等消化,浓缩于多孔吸附柱上,MALDI-MS肽指纹图,数据库查询,蛋白质鉴定,已知,反向HPLC分离,MALDI-MS，PSD片段分析,示知,ESI-MS-MS、微测序,实验方法 完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）,肽混合物,质谱测定肽质量 （MALDI-MS,ESI-MS),选择肽段裂解 PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS),计算方法 蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）,肽质量检索：片1.ppt,未解析碎片离子检索：片2.ppt,酶切,质谱鉴定蛋白质的策略,体外 pmol,32P蛋白质标记,蛋白质分离,蛋白酶切,2D磷酸化做图,LC-ESI-MS或MALDI-MS,LC-ESI-MS,HPLC,IMAC,磷酸化氨基酸分析,体内,32P细胞标记,蛋白酶切,2D磷酸化做图,相关分析,磷酸化位点分析策略,实验样品的制备原则,应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,增加样品溶解性的手段,变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。常用尿素和CHAPS联合，但所得的样品容易吸附在IPG胶条的基质中而丢失，目前发明的硫尿的作用更强，但溶解度相对较差，常用2M硫尿57M尿素混合使用。,表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。SDS作用后不利于稳定IEF中的等电点，不宜存在于IEF的样品溶解液中；只有后两类表面活性剂是可用的，其中CHAPS和SB3-10最好。 常用浓度为在8M尿素溶液中含25%的CHAPS，但在含高浓度硫尿的溶液中其作用有限；SB3-10是一种含有长线性基团尾端的两性去污剂，其作用要强于CHAPS，但在尿素浓度大于5M时不溶解。 现在总结的两种IEF溶解液的配方是5M尿素2M硫尿2%CHAPS2%SB3-10，适用于需要强烈表面活性剂的蛋白样品的溶解；和7M尿素2M硫尿4%CHAPS，适用于需要高浓度变性剂的蛋白质样品的溶解。,还原剂：变性剂和表面活性剂是用来变性蛋白、暴露和溶解其疏水区域的。为了让大多数蛋白完全展开，还有必要来还原二硫键。 常用的还原剂有具游离巯基的巯基乙醇（ME）和二硫苏糖醇（DTT）。但DTT是带电荷的物质（尤其在碱性条件下），在IEF时则迁移出pH梯度，导致一些蛋白（通常是易于通过二硫键在内部起作用的蛋白）的溶解性丢失。如果用不带电荷的三丁基膦（TBP）来代替DTT则效果更好，不但能增加蛋白的溶解性，而且有助于样品在2-DE过程中从第一相转移到第二相；另外TBP不带巯基，不需被烷基化，从而简化了IPG的平衡过程。,起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。 Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。 应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。,亚蛋白质组样品的制备,主要是应用超速离心技术和顺序抽提法将总蛋白质组分成不同的蛋白质组亚群，再用适当的蛋白溶解液溶解，以降低样品的复杂性、提高分辨率。常用方法为： 1、用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解，这不仅大大减少样品的复杂性，而且展示出的蛋白质可确定其亚细胞定位。该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。,2、根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行顺序抽提，从而分离出具有不同溶解度范围的蛋白质组亚群。 一般分3个层次： 第一步用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第二步是把未溶解的小片（pellet）用常规IEF样品液（8m尿素4%CHAPSDTT）溶解，这次抽提剩下的小片主要是富集的膜蛋白，约占整个样品的11%（W/W）； 第三步是用增强的蛋白溶解液5M尿素2M硫尿2%CHAPS2%SB3-102MTBP作最后的抽提。,预分步收集,细胞浆,细胞核,细胞膜,核糖体及其他特定细胞成份,细胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,pH3-4,pH4-5,pH5-6,pH6-7,pH7-8,pH8-9,pH9-10,pH10-11,pH11-12,第一步,第二步,第三步,用窄pH范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白,阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质,亚蛋白质组阵列策略的框架图,3倍,3倍,特殊样品的制备,低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。 高不溶性蛋白的分离：主要还是要增加蛋白质的溶解度，采用顺序抽提法进行。,碱性蛋白：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。 极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在常规Tris/glycine缓冲液中，样品和缓冲液中游离的dodelcyl sulfate ions将持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。,样品中DNA的去除,DNA/RNA等可以同蛋白质形成超大分子量的复合物，从而影响蛋白质的电泳分离。 一般在用40mM Tris溶液裂解细胞时，加入DNA消化酶，即可有效去除DNA。 量：1ml溶解液中加入150300U的内切核酸酶，室温反应20min即可。,蛋白载样量,影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括： 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。 电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。 待研究蛋白的丰度： 样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。 IPG胶条的pH范围：,样品制备和一向电泳时应严格防止角蛋白的污染。,双向电泳样品的其它来源 Cell disruption: Immunoprecipitation: Plant cell sample: Subcellular organelles: Microdissection:,样品液的准备,标准液：,Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use,Multiple chaotropic agent solution preparation,Multiple surfactant solution preparation,IPG胶条的蛋白质大约载样量,IEF的基本条件,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,total,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20,000V-hr,40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的； 非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。 非变性/还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素5%-ME2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的