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秦淮中学2015届高三生物一轮复习 要点知识与复习导学案选修11：酶的应用一、酶在洗涤等方面的应用【选学（了解）】果胶酶及其应用：1. 果胶酶：是指一类酶的总称。包括：半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶。2. 果胶酶的来源：来自霉菌等微生物。常采用霉菌等微生物发酵的方法生产果胶酶。提取果胶酶的条件：低温（04）、偏酸环境（pH：34）、激活剂（10%NaCL）。3. 果胶酶的作用：能分解植物细胞壁及胞间层的果胶。4. 果胶酶的应用：常用于提高果汁的出汁率和澄清度。5. 探究果胶酶作用的最适条件（最适温度和pH）和用量的实验要点：遵循单一变量原则和对照实验原则。以果汁出汁量或澄清度作为判断酶活性的指标。（一）酶在洗涤方面的应用【A】1. 普通洗衣粉的主要成分：表面活性剂、软水剂（三聚磷酸钠）、碱剂、漂白剂、香精等。 表面活性剂：是洗衣粉的核心成分，作用：降低表面张力。 2. 加酶洗衣粉：是指加入了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的洗衣粉。（1）酶不能直接加入洗衣粉，所加的是用特殊化学物质包裹成的复合酶制剂。加入洗衣粉的酶制剂不是固定化酶，其包裹材料能溶于水。加入洗衣粉中的酶来源：基因工程生产的酶。能耐酸、耐碱、耐较高温度等。（2）加酶洗衣粉降低了表面活性剂和三聚磷酸钠的用量。使用加酶洗衣粉不仅能增强了洗涤效果，还能减少对环境的污染（磷污染）。（3）在洗涤剂中应用最广泛、效果最明显的酶是： 碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。3. 酶制剂的洗涤原理：（1）碱性蛋白酶：可将血渍、奶渍等中蛋白质分解成可溶性氨基酸和易脱落小分子多肽。（2）碱性脂肪酶：可将油渍、汗渍和口红等中的脂肪水解成脂肪酸和甘油等。（3）淀粉酶： 可将面、粥等中的淀粉水解为麦芽糖、葡萄糖等可溶性成分。（4）纤维素酶：本身不能去污垢，但能使纤维结构变得蓬松，利于洗衣粉与纤维深处污垢接触，增强洗涤效果。纤维素酶能去除衣物浮毛，不会分解衣物纤维素。4. 加酶洗衣粉使用注意事项：（1）不能用于洗涤：毛织品和丝织品等蛋白质类衣物（2）不能用70及其以上水温洗涤。（适宜水温：3550；适宜pH：911）。（3）不宜长期存放（酶会失效）。加酶洗衣粉对人的皮肤有腐蚀性，应注意防护。（二）探究加酶洗衣粉洗涤效果实验【B】1. 观察指标：（各实验都是）污物消失时间（或污物缩小的面积）。2. 各对照实验共有的无关变量：水用量、洗衣粉用量、污物量、布的质地大小、洗涤方式、浸泡和洗涤时间等。3. 比较普通洗衣粉与加酶洗衣粉洗涤效果的实验： 自变量：洗衣粉种类。 无关变量：除共有的外，还有水温、pH、洗衣粉品牌。4. 探究不同种类加酶洗衣粉洗涤效果的实验：自变量：加酶洗衣粉种类。无关变量：除共有的外，还有水温、pH等。5. 探究使用加酶洗衣粉的最适宜温度实验：各组温度形成自身对照。 （1）自变量：温度。 无关变量：除共有的外，还有pH等。（2）应在最适温度左右等梯度设置多组温度进行对照实验。温度梯度越小越准确。6. 探究使用加酶洗衣粉的最适宜pH实验：各组pH形成自身对照。 （1）自变量：pH。 无关变量：除共有的外，还有水温等。（2）应在最适pH左右等梯度设置多组pH进行对照实验。pH梯度越小越准确。二、制备和应用固相酶： （一）固定化酶和固定化细胞技术及其应用【A】：1. 固定化酶：是指用物理学或化学方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。固定化酶可以反复使用，原因是酶与水溶液反应物和产物可以分离。2. 制备固定化酶的主要方法：包括：吸附法、交联法、包埋法等。交联法 吸附法 包埋法（1）吸附法：利用离子键、物理吸附等方法将酶分子吸附在固相载体的表面。（2）交联法：利用（双）多功能试剂进行酶与载体之间交联，形成三维网状结构。（3）包埋法：将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔载体中。 常用固相载体：海藻酸钠、纤维素、琼脂糖、明胶、聚丙烯酰胺、多孔玻璃等。3.制备固定化酶（细胞）的要求和方法选择： （1）选择的固定化方法及材料不能影响酶活性；要避免高温、强酸、强碱等。（2）制备固定化酶时：常用吸附法和化学结合法，不用包埋法。酶分子小，容易从包埋材料中漏出。（3）制备固定化细胞时：常用包埋法。 不用吸附法和化学结合法。细胞个大，难以吸附或结合，不易从包埋材料中漏出。4. 直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较：主要优点主要缺点直接使用酶催化效率高，耗能低、低污染。不能反复使用，影响产品质量。固定化酶能与产物分离，能反复使用。易与反应物接触。不能催化系列反应。固定化细胞能与产物分离，能反复使用。能催化系列反应。酶活性高而稳定、操作容易，成本更低酶不易与反应物接触，反应效率降低。只能用于生产胞外酶和分泌到细胞外的产物。5. 固定化酶的应用实例：（1）固定化葡萄糖异构酶：用于生产高果糖浆。见右图：（2）固定化青霉素酰化酶：用于生产各种新型青霉素。（3）尿糖试纸：测试尿糖。（含量：浅蓝浅绿棕色浅棕色）。 尿糖试纸上含固定化葡萄糖酶和过氧化氢酶及无色化合物。 尿糖试纸不能反复使用，因为用过的试纸上有颜色。（4）固定化硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶：进行废水处理。（二）固定化酵母细胞的制备与应用（实验）【B】1. 制备固定化细胞常用凝胶包埋法。制备固定化酵母细胞常用海藻酸钠凝胶包埋法。凝胶是多孔载体，调节凝胶溶液的浓度，可以改变凝胶的孔径大小。2. 制备固定化酵母细胞的方法步骤：关键步骤：配制海藻酸钠溶液。（1）活化酵母细胞：目的：使酵母菌从休眠状态恢复到正常生活状态。 操作：将1克干酵母和10ml蒸馏水放在50ml烧杯中混合并搅拌均匀，放置1小时。 注意事项：容器要大一些，以防活化液溢出；混合后要进行搅拌。（2）配制0.05mol/L的CaCL2 溶液：操作：将0.83克无水CaCL2和150mL蒸馏水，放在200ml烧杯中使其充分溶解。 CaCL2溶液的作用：（起凝胶聚沉作用）促使凝胶珠的形成。（3）配制海藻酸钠溶液（最关键）： 操作：将0.7g海藻酸钠和10ml蒸馏水加入50ml小烧杯中，小火间断加热至完全溶化，加蒸馏水定容至10ml。注意事项：应采用小火间断加热，以防焦糊；海藻酸钠浓度不宜过高过低。海藻酸钠溶液浓度过高时：难以形成凝胶珠或凝胶珠形态异常。海藻酸钠浓度过低时：凝胶珠中包埋的细胞数量少，凝胶珠色浅呈白色。（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：应将海藻酸钠溶液冷却至室温后，再加入已活化的酵母细胞；并充分搅拌均匀。（5）固定化酵母细胞：操作：用注射器吸取混合液，以恒定的速度缓慢地滴加到CaCL2溶液中，并不断搅拌（磁力搅拌器搅拌），将凝胶珠在CaCL2溶液中浸泡30分钟。注意事项：注射器距液面距离不能太近、凝胶珠浸泡时间不能过短。注射器距液面距离过近时：凝胶珠会出现拖尾现象。凝胶珠浸泡时间过短时：凝胶珠不能形成稳定结构，容易裂开。（6）冲洗：取出凝胶珠后，要用蒸馏水冲洗23次。冲洗的目的：洗去凝胶珠表面的氯化钙溶液和杂菌。（7）发酵实验：将10%的葡萄糖溶液150ml加入200ml的锥形瓶中，加入固定化酵母细胞在25下发酵24h。观察气泡产生（CO2）和闻酒味，并用重铬酸钾检测酒精。3. 实验结果分析：酵母细胞凝胶珠质量检测。（1）合格凝胶珠的标准：乳白色，圆形或椭圆形。摔打容易弹起。挤压不易破裂、无液体流出。（2）凝胶珠异常的原因： 色浅呈白色：海藻酸钠溶液浓度偏低，此种凝胶珠中包埋的酵母细胞数量少。 不呈圆形或椭圆形：海藻酸钠溶液浓度偏高。此种凝胶珠为制作失败，不能使用；需要重新制作。 拖尾现象：混合液浓度低，或注射器距氯化钙溶液液面距离太近。凝胶珠漂浮：混合溶液中含气泡。 凝胶珠容易裂开：凝胶珠在氯化钙溶液中浸泡时间过短。选修12：生物技术在食品加工中的应用一、发酵食品加工的基本方法【A】（一）传统发酵中所利用的微生物的比较：酵母菌醋酸菌毛霉乳酸菌生物类型真核生物原核生物真核生物原核生物代谢类型异养兼性厌氧型异养需氧型异养需氧型异养厌氧型适宜生长温度182530351518室温主要用途酿酒、发面酿醋制作腐乳制酸奶、泡菜（二）各类发酵食品的制作原理及方法：1. 制作果酒原理：以果汁为原料，利用酵母菌在无氧条件下（酒精发酵）产生酒精。（1）自然发酵：利用附着在葡萄皮上的野生型酵母菌进行酒精发酵。（2）工业生产上：用人工培养的纯种酵母菌进行酒精发酵。（3）红葡萄酒是用带皮葡萄酿制而成，白葡萄酒是用去皮葡萄酿制而成。（4）果胶酶可用于酒的陈酿化；蛋白酶可使酒体清澈透明。2. 制作果醋原理：以果汁或果酒为原料，利用醋酸菌在有氧条件下产生醋酸。3. 制作腐乳的原理： 利用毛霉等微生物分泌的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶将豆腐中的蛋白质、脂肪和淀粉分解为多种氨基酸、有机酸等；使腐乳鲜香可口，易消化吸收。（1）在腐乳制作中，多种微生物参与了豆腐的发酵，但起主要作用的是毛霉。毛霉是丝状真菌，其代谢类型属于异养需氧型；适宜生长温度：1518。 毛霉孢子分布广泛，空气中含有大量毛霉孢子。（2）家庭和实验制作腐乳时，将豆腐坯暴露在空气中接种毛霉孢子。（3）工业生产腐乳时，在严格无菌条件下接种优良毛霉菌种孢子。腐乳品质好。工业上生产腐乳步骤：接种孢子。培养和晾花。压坯与装坛“晾花”的目的：增强酶的作用，散失霉味。 （4）醉方（添加黄酒制成）、红方（添加红曲制成）、青方（不加调料制成）。4. 酸奶和泡菜制作原理：利用乳酸菌在无氧条件下发酵产生乳酸。（1）泡菜中亚硝酸盐含量变化规律：先增加再下降至原含量水平。 （2）泡菜制作要求：压实和严格密封。加盐量不宜过多过少，控制在5%。（3）食用时间：腌制1011天以后。是否能食用，需要检测亚硝酸盐含量。 比色法检测：将样品液显色情况与亚硝酸钠标准显色液比较估测出其含量。不同浓度的显色液呈不同程度的玫瑰红色。二、果酒和果醋的制作【B】（一）果酒制作：果酒中酒精含量应控制在10%20%。1. 果酒制作方法步骤（及注意事项）： （1）对发酵瓶、纱布、榨汁机等进行清洗和消毒：发酵瓶要用温水反复清洗后，再用75%酒精擦拭消毒，晾干。 （2）取葡萄500克，先冲洗干净，再去除枝梗和腐烂籽粒，再次冲洗。冲洗目的：去除葡萄表面污物杂物。不能先去枝梗再冲洗。 不能反复冲洗，否则会冲洗掉附着在葡萄表面的野生型酵母菌。 （3）用榨汁机榨取葡萄汁，之后将葡萄汁装入发酵瓶中，并盖好瓶盖：【注意】果汁不能装满（装入量不超过发酵瓶总体积的2/3）。目的是：让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，保证发酵时有较大起始数量。 防止发酵时发酵液溢出。（4）将发酵瓶放置在1825条件下发酵1012天：（5）每天定期排气12次（排CO2），以防瓶爆裂。 为了防止发酵瓶爆裂，最好选用塑料瓶。 排气时要防止杂菌污染，常拧松瓶盖排气，不能打开瓶盖。 右图发酵装置中排气管设计成长而弯曲状，既能排气，又能防止杂菌污染。 （6）取样检测酒精（10天后）：用酸化重铬酸钾检测；也可闻酒味、镜检酵母菌。【检测方法】取两支试管编号1、2，分别装入2mL酒精、2mL发酵液。向两试管中分别滴加3滴3mol/L的硫酸溶液，并振荡混匀。再向两试管中各加入饱和重铬酸钾溶液3滴，振荡后观察溶液颜色变化。2.制作果酒和果醋中防止杂菌污染的措施：（1）对用具清洗并用酒精消毒。 （2）葡萄先清洗后除枝梗。（3）排气管设计为长而弯曲状。 （4）无菌操作。（二）果醋制作： 1. 利用葡萄汁等果汁制作果醋：（1）要向果汁中接种醋酸菌，并置于3035条件下进行有氧发酵。酶（2）发酵时需要不断通入无菌空气，同时也需要定期排气（排CO2）。（3）反应式：C6H12O6 2O2 2 CH3 COOH 2CO22 H2O能量2. 利用果酒制作果醋的方法步骤：（1）将醋酸菌（醋曲或醋酸菌膜）接种到制作好的果酒中，并通入无菌空气。（2）将发酵装置放在3035环境中，不断通入无菌空气进行有氧发酵78天。（3）检测果醋是否制作成功，并对发酵液（果醋）进行过滤、灭菌：【检测方法】pH测定、观察醋酸菌膜形成、闻酸味、品尝、镜检等。【提醒】变酸的果酒表面白色菌膜是由醋酸菌形成的。酶 泡菜坛内表面白色菌膜是由酵母菌形成的。（4）果酒制果醋反应式： C2H5OH O2 CH3 COOH H2O 能量（三）果酒制作与果醋制作的比较： 果酒制作果醋制作发酵菌种酵母菌醋酸菌最适发酵温度18253035对氧气需求前期需氧，后期不需氧一直需要氧pH4.05.85.46.3发酵时间1012天78天方法与流程挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵（果酒）醋酸发酵（果醋）三、腐乳的制作【A】1. 腐乳制作的基本流程：见下图：让豆腐上长出毛霉 直接接种或利用空气中毛霉孢子，1518培养。 加盐腌制 逐层加盐，随层数增高而增加盐量；近瓶口处铺厚些。 加卤汤装瓶 卤汤由酒和香辛料配成。 密封腌制 用酒精灯对瓶口灭菌后密封。（1）让豆腐上长出毛霉：将豆腐切成小块（4cm4cm1.5cm），用沸水消毒后微微晾干，制成腐乳坯。在晾干过程中空气中毛霉孢子落到腐乳坯上，完成接种过程。所用豆腐含水量应控制在70%左右，含水过多腐乳不成形。将腐乳坯竖立放在清洁容器内彼此间隔1cm，将温度控制在1518，并保持一定湿度让毛霉生长；当菌丝变成淡黄色，有大量灰褐色孢子形成时停止发酵。若某些豆腐上长出青霉，应剔除这种豆腐或重新制作。（2）加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块用食盐水清洗后整齐地摆放在瓶中，用食盐腌制10天。加盐方法：逐层加盐，加盐量逐层递增，接近瓶口的表面盐要铺厚一些。盐量：腐乳坯量= 5 ：1。加盐过多会影响继续发酵，过少豆腐会腐败变质。【加盐目的】析出豆腐中水分，使豆腐变硬，防止过早酥烂。 抑制微生物生长，防止豆腐腐败变质。 调节口味。（3）配制卤汤：用食盐、水和料酒及各种香辛料等进行配制。卤汤中酒含量控制在12%左右。酒的作用：抑制微生物的生长，并使腐乳具有独特酒香味。 酒用量过多会抑制蛋白酶活性和影响腐乳风味；酒用量过少豆腐会腐败。 香辛料的作用：调味、防腐杀菌。（4）加卤汤装瓶，密封腌制：将配制好的卤汤加入瓶中，将瓶口通过酒精灯火焰，再用胶带密封瓶口，密封腌制6个月。 装瓶时要迅速，瓶口要通过酒精灯的火焰，再密封。2. 腐乳品质鉴定及有关提醒：（1）评价腐乳品质：应从形状、色、香、味、质地等方面进行评价。（2）影响腐乳品质的因素：盐、酒、香辛料和发酵温度。 前期发酵温度为：1518；后期发酵温度（腌制时）为常温或30。 在腌制过程中，毛霉等微生物（酶的作用）仍可继续发酵一段时间。（3）腐乳外表的皮是附着在豆腐上的毛霉菌丝形成的，可使腐乳成形。（4）用于腌制的玻璃瓶洗刷干净后要用沸水消毒，装瓶、密封等环节要无菌操作。选修13：微生物的利用一、微生物的分离和培养【A】（一）微生物与培养基：1. 微生物：是指除动物界和植物界以外的所有生物，包括病毒、原核生物、真菌和原生生物等2.培养基：是指为人工培养微生物而制备的，适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。3.培养基的营养成分：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等，有的还含生长因子。 （1）碳源：如：无机碳（含碳无机物）、有机碳（糖类、脂质、蛋白质等）。无机碳：能为自养微生物提供碳素营养。无机碳是自养微生物的碳源。有机碳：能为异养微生物提供碳素营养和能源。（2）氮源：如：无机氮（含氮无机物）、有机氮（蛋白胨、尿素、氨基酸等）。 为微生物提供氮素营养。 氮气（N2）是固氮微生物的氮源，（3）水和无机盐：分别为微生物提供水、无机盐营养。（4）生长因子：如：维生素、必需氨基酸、碱基等，满足异养微生物合成酶和核酸。【提醒】含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源和能源。 蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、麦芽汁等既含碳源又含氮源、生长因子等营养。4. 培养基的种类及其用途：（1）按物理状态可将培养基分为：液体培养基、半固体培养基和固体培养基。 液体培养基：未加凝固剂（琼脂）。主要用于工业生产。半固体培养基：加入琼脂0.20.5%。用于观察微生物的运动、分类和鉴定。固体培养基：加入琼脂1.52%。用于微生物的分离、纯化、计数和鉴定。琼脂是最常用凝固剂，熔点：96，凝固点：40，微生物一般不能利用琼脂。（2）按化学成分可将培养基分为：合成培养基和天然培养基。合成培养基：化学成分明确。 用于微生物的分类和鉴定。天然培养基：化学成分不明确。用于工业生产。（3）按用途（或功能）可将培养基分为：基础培养基、选择培养基和鉴别培养基。制备方法主要用途实例基础培养基含微生物生长所需要的基本物质选择培养基添加或缺少某种化学物质从众多微生物中分离出所需微生物加入青霉素分离酵母菌、霉菌等。加高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌无氮培养基分离固氮菌。不含有机碳培养基分离自养微生物鉴别培养基加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物伊红美蓝培养基可使大肠杆菌的菌落呈深紫色，可以鉴别大肠杆菌。5. 培养不同微生物所需要的温度、pH和时间：细菌放线菌霉菌培养温度303730372528 培养基pH6.57.57.58.55.06.0 培养天数12d57d34d（二）微生物培养中的无菌操作技术：1.无菌操作：是指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 获得纯净培养物的关键：防止外来杂菌入侵（污染）。2.消毒与灭菌的区别：条件效果与目的常用方法消毒较温和的物理或理化方法杀死物体上大部分有害微生物部分灭菌，不包括杀灭芽孢和孢子。煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药剂消毒法等灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。3.常用消毒方法：（1）煮沸消毒法：100煮沸56min。常用于罐装食品、日常食品的消毒。（2）巴氏消毒法：7075下煮30min或80下煮15min。用于牛奶、果汁消毒。（3）化学药剂消毒法：7075%酒精、碘酒、新洁尔灭等可用于皮肤、伤口等处消毒。 氯气用于水源消毒。（4）紫外线消毒：30W紫外线灯照射30min。用于对接种室的空气进行消毒。4.常用灭菌方法及其应用： 主要方法（及器械）适用范围灼烧灭菌用酒精灯火焰（外焰）灼烧接种环、接种针、试管口、三角瓶口。干热灭菌置于干热灭菌箱中，160170加热12h。培养皿、试管等玻璃器皿，不适合其他方法灭菌的金属用具等高压蒸气灭菌（湿热灭菌）置于高压灭菌锅中100 kPa、121、1530 min培养基、无菌水及多种器材、物品。5.无菌技术具体做法： （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洗和消毒。（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近（旁）进行。（4）实验操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。6.（高压灭菌锅）高压蒸汽灭菌的操作方法： （1）加水：装水量要没入电热管，以防干烧爆裂，加水后放入灭菌桶。（2）装锅：将所要灭菌的材料装入锅内。（不要装得太满），（3）密封：盖上锅盖，两两对称地拧紧螺栓。（4）加热排气：打开排气阀，接通电源加热；约2分钟后有气体排出，排气约5分钟后关闭排气阀。【注意】一定要将冷空气排尽，否则达不到灭菌效果。（5）保温保压：当压力上升至100kPa（0.1MPa）或温度达121时,维持2030分钟；然后关掉电源。 （6）出锅：待压力表指针回到零，温度下降至60以下，打开排气阀，开盖取出锅内物品。一定要等到压力表指针回到零时，才能排气开盖。否则压力过大会导致培养基等内容物冲出，造成污染。 灭菌完成后要将锅内余水倒出，保持内壁内胆干燥。（三）培养基的配制、灭菌和倒平板。1. 培养基的配制原则：目标要明确。营养要协调。pH要适宜。2. 细菌培养基的配制：牛肉膏蛋白胨培养基的配制过程：1000mL牛肉膏蛋白胨固体培养基配方成分牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂含量5.0g10.0g5.0g20.0g将上述物质溶解后，添加蒸馏水定容至1000mL（1）计算和称量：根据表中配方计算培养基各成分用量，并逐一称取。【注意】牛肉膏和蛋白胨容易吸潮，称取时动作要迅速。牛肉膏粘稠度较大称取时要细心。（2）溶化：将称取的各成分与水混合后进行加热溶化。 应将称量好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯；待溶化干净后取出。在加热溶化过程中要用玻璃棒不断搅拌，以防止糊底而导致烧杯破裂。（3）调节pH：用pH试纸测pH，通过滴加3%HCI或NaOH将pH调到7.07.5。（4）分装：将培养基分装到试管或三角烧瓶中，分装好后用棉塞塞紧管口或瓶口。培养基分装量：试管：为其高度的1/5。三角烧瓶：不超过瓶容积的1/2。分装时培养基不能污染试管口或瓶口。对试管或三角烧瓶要标记和编号。（5）包扎：试管：35支扎成一捆，外包一层牛皮纸（防污染），用线扎好。三角烧瓶：用牛皮纸包扎好，以防水蒸汽污染。（6）灭菌：将包扎好的试管或三角烧瓶放入高压灭菌锅内进行高压蒸汽灭菌。培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，160170下灭菌12h后备用。（7）倒平板：待培养基冷却到50左右（刚刚不烫手）在酒精灯火焰附近倒平板。将灭菌过的培养皿放在酒精灯火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拨出棉塞。右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰2-3次，以防瓶口附近微生物污染培养基。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基约1020mL倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固，约需要510 min；然后将平板倒过来放置。 平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上冷凝水落入培养基，造成污染。倒平板操作应在酒精灯火焰附近进行，以防杂菌污染。倒平板时，培养基不能溅在皿盖与皿底之间的部位，也不能溅在皿盖与皿壁上。若是装入试管的培养基，灭菌后要搁置斜面，斜面长度不超试管长度的1/2。（8）无菌检查：检查培养基灭菌是否彻底，方法是：将灭菌的培养基放入37的恒温箱中培养2448h，观察有无菌落形成。（四）微生物接种技术： 1.接种器具：包括：接种环（划线接种）、接种针（穿刺接种）、玻璃刮铲（涂布用）。2.接种方法：包括：平板划线法、涂布平板法、穿刺接种法、斜面接种法等。 微生物分离纯化的最常用接种方法：平板划线法和稀释涂布平板法。3. 平板划线法：特点：操作简单，但单菌落不易分离。（1）原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步 稀释分散到培养基的表面。在数次划线后, 可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.（2）操作方法：将接种环放在火焰上灼烧，至接种环烧红；在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰数次，将已经冷却的接种环伸入菌液，沾取一环菌液。将试管口通过火焰数次，并塞上棉塞。左手将培养皿盖打开一条缝隙，右手将接种环迅速伸入平板内，划35条平行线，盖上培养皿盖。【注意】不要划破培养基。烧灼接种环，待接种环冷却后；从第一区域划线的末端开始往第二区域划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。最后区域不能与第一区域相连。将平板倒置，放入恒温箱中培养。 （3）【提醒注意】 接种全过程都需要在酒精灯火焰旁进行，每次划线前后都要灼烧接种环。 第一次划线前灼烧接种环的目的：烧掉接种环上被污染的杂菌。 第二次及其之后划线前后灼烧接种环的目的：烧掉接种环上残留的菌种。 每次划线接种时都需要将灼烧的接种环冷却后才能划线，以防烫死菌种。 接种划线时不能划破培养基，最后区域所划线不能与第一区域的相连4. 稀释涂布平板法：特点：操作复杂，但单菌落容易分离。（1）原理：将菌液进行一系列的梯度稀释（常为10倍梯度），然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂平板表面，经过培养，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，在培养皿表面形成单个菌落。（2）操作方法： 取合适稀释度的少量菌液（0.5mL）在酒精灯火焰附近滴加到平板表面。 从酒精溶液中取出涂布器，把涂布器上粘附的酒精在酒精火焰上燃尽灭菌。 在酒精灯火焰附近，用冷却后的涂布器（即玻璃刮铲）把菌液涂布均匀。 把用涂布接种的培养皿放在恒温箱中（37恒温）培养12天取出。稀释涂布平板法统计的菌落数目比活菌的实际数目少。原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是1个菌落。（五）菌种保藏方法：1. 临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2. 长期保存：甘油冷冻管藏法（即：甘油管藏法。20保存）。二、微生物的分离和培养（实践）【B】（一）分离纯化大肠杆菌：1. 配制牛肉膏蛋白胨培养基：包括：计算称量溶化（含调pH）灭菌倒平板。2. 分离纯化大肠杆菌的接种方法：划线平板法和稀释涂布平板法。3. 接种后的培养基的培养：置于恒温箱中37培养12d。4. 挑取大肠杆菌菌落多次进行接种培养可以纯化大肠杆菌菌种。5. 菌种保存方法：临时保藏（4保存）和长期保存（甘油管藏：20保存）.（二）土壤中分解尿素的微生物的分离与计数：1.筛选原理及方法：（1）原理：尿素分解菌能合成脲酶，能利用脲酶分解尿素，因此可以尿素为氮源。（2）筛选方法：用以尿素为唯一氮源的培养基培养土壤微生物进行筛选。2. 实验方法步骤：本实验采用稀释涂布平板法和活菌计数法。（1）土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。【注意】取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。（2）制备培养基：按下列配方制备以尿素为唯一氮源的培养基。KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂pH调至7.07.2，加蒸馏水定容至1000ml1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g需要设置无尿素培养基作空白对照，即：表中尿素用等量的无菌水替换。（3）土壤样品稀释：制备不同稀释度的土壤悬液。方法如下： 称取0.5g土壤，倒入盛有50mL无菌水的锥形瓶，振荡20min，充分打散土壤，制成102g/mL的土壤悬液。用无菌移液管吸取0.5mL（102g/mL）的土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的1号试管，配制成103g/mL的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸1号管3次，使悬液均匀，再吸取0.5mL注入盛有4.5mL无菌水的2号试管，配制成104g/mL的土壤悬液.。依此类推，配制105、106、107、108g/mL的等浓度的土壤悬液。 每次吸取土壤悬液前都要用移液管吹吸悬液3次的目的：使土壤悬液均匀。 分离不同的微生物采用不同稀释度（因不同微生物在土壤中含量不同）。见下表：细菌放线菌霉菌稀释度104、105、106103、104、105102、103、104目的保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板【提醒】人教版是配制10mL不同浓度的土壤悬液，其方法与上述方法相同。（4）接种：采用（稀释）涂布平板法。具体操作如下： 从最低浓度（108g/mL）土壤溶液开始，分别用无菌移液管吸取1mL（人教版为0.1mL）加入到相应编号的培养基中，每个浓度设置至少3个重复（三个平板），再用涂布器（玻璃刮铲）涂布均匀。 每次吸取土壤悬液前都要将土壤悬液充分振荡，混合均匀；每一步都应做到无菌操作。操作时，移液管和试管口应在离火焰12cm处。实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。（5）培养与观察：将已标明培养基种类、培养日期和样品稀释度的培养皿，倒置放在37的恒温箱培养12d，观察细菌菌落。（6）计数菌落：每隔24h统计菌落一次，选取菌落数目稳定时的数据作结果，以防止培养时间不足而遗漏某些菌落。计算时应选择菌落数为30300的平板上进行计数，要计算平均数。每克样品菌落数（用液1mL）某一稀释度重复培养菌落平均数稀释倍数。统计的菌落数比活菌的实际数目少。原因是：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是1个菌落。4. 结果分析与评价： 同一土样的重复组统计的结果应相近。（1）若未接种的培养基中没有菌落，说明培养基未被杂菌污染，反之，则被污染。（2）若空白对照组培养基上有菌落生长，原因可能是被固氮微生物污染或培养基中混入了其他氮源。（3）若实验中得到2个或2个以上菌落数在30300的平板，表明稀释操作成功，可以进行计数统计。（4）若同一稀释度的3个重复的菌落数相差悬殊，表明试验不精确，需要重新实验。【知识拓展】1土壤中微生物数目的统计方法：包括：直接计数法和间接计数法（活菌计数法）。（1）直接计数法：用血球计数板制片后在显微镜下观察计数。 取样计数方法与培养液中酵母菌计数方法类似。 土壤微生物的稀释要求：以达到每小格内有510个菌体为宜。经稀释的土壤样品应重复计数3次，取其平均值。 1mL土壤悬液中菌体总数 = 4106每小格中的菌体数土壤悬液稀释倍数。（2）间接计数法（活菌计数法）采用稀释涂布平板法，统计菌落数进行计数。要设置对照和重复，每个稀释度土壤悬液至少设置3个重复。选择菌落数为30300的平板上进行计数，并计算平均数。每克土壤样品中菌落数菌落数 稀释倍数 涂布体积。2. 鉴定能分解尿素的微生物的方法：脲酶检测法。（1）原理：尿素经脲酶分解