工业微生物菌种的筛选.ppt

第二章,工业微生物菌种选育,工业微生物育种的必要性,发酵工业的目的是为人们提供各种各样的发酵产品，菌种的特性是发酵能否成功的关键，野生菌株不会积累过多的代谢产物，我们需要对野生菌株改造，使其符合人们的要求（高代谢产物及其它特性等）；这个过程就是育种。,工业微生物育种方法,自然选育 诱变育种 杂交育种 基因工程育种,工业微生物菌种的筛选步骤,菌株的筛选通常分采样 富集分离筛选产物鉴别等步骤.,出发菌株采样,向菌中保藏机构购买或索取 向其它机构购买或索取 从自然界采样,从自然界采样,从土壤中采样 根据微生物特点采样,从土壤中采样,土壤有机质状况 土壤酸碱度和植被状况 地理条件 季节变化,根据微生物的生理特点,产纤维素酶 产蛋白酶 产淀粉酶,糖化酶 以碳氢化合物为底物的菌种等,采样方法,出去表层5CM左右的土层,取525CM的土样1015克(北方土壤干燥,可在10-30CM处取样),装入事先准备好的容器内,编号并记录地点 土壤质地 植被状况取样时间及其它环境条件等.,富集培养,富集培养是根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,取样品少许加入培养基中,给目的微生物一个最适的生长环境,经过一定时间的培养,目的微生物在数量上占绝对优势,可有效地分离出所需要的菌株.,富集培养方法,富集培养主要根据微生物的碳氮源PH温度需氧等生理因素加以控制. 举例一:分离纤维素水解酶产生菌 举例二:分离耐高渗透压的酵母,分离,纯化分离,包括稀释分离法和划线分离法 组织分离法（常用于病变组织或特殊组织） 控制营养和培养条件,控制营养和培养条件,控制培养基中的营养成份 控制培养基的PH 抑制不需要的菌类 加温处理 利用指示剂或呈色剂的生化反应等,工业微生物的诱变育种,微生物育种是建立在遗传和变异的基础上的,一个菌种生物合成代谢产物的产量和质量由遗传因素所决定.一个性能好的菌种只有在合适的条件下才能表现出来.因此诱变育种的包括诱变 筛选和优化环境条件三个重要环节.,人工诱变育种的目的,提高有效产物的产量. 改善菌种特性 提高产品质量.例如:孢子生长力强,产泡沫少,需氧量低,抗噬菌体,耐高温等. 开发新品种.,人工诱变育种的优点,人工诱变育种能加速基因突变,可大大地提高突变株的数量.具有速度快 收效大 方法简单等优点.,育种前准备工作,了解菌落的特征以及和生产性能的关系 了解产物的代谢途径. 了解影响菌种发育的主要因素. 建立一个准确 简便 快速检测突变株和产物的方法. 研究最佳保藏条件.,诱变育种方法与步骤,出发菌株的选择. 菌悬液制备. 诱变剂选择. 诱变处理方法. 突变株纯化及分离.,出发菌株的选择,选择具有一定生产能力或某种特性的菌株作出发菌株. 选择纯种作出发菌株. 选择菌株应考虑稳定性. 采用多出发菌株. 选择出发菌株的其它因素.,出发菌株的纯化,将液体培养物或从斜面移接菌体细胞到0.9%生理盐水中,按10倍稀释法,逐一稀释到10-610-5,从适当浓度的稀释管中吸取0.1毫升,于事先准备好的琼脂平板上均匀涂抹,培养后,挑取一定数量(3050个)菌落,进一步培养鉴定,最后确定遗传性状稳定菌株供诱变处理.,单孢子菌悬液制备,菌悬液要求:对进行诱变的菌体要保持同步,同时又要处在最旺盛的对数期. 菌悬液制备方法(细菌):把经过2024小时培养的新鲜斜面,移到装有基本培养基的三角瓶中,于370C振动培养到对数期(1618小时).接着于60C培养1小时, 使之同步生长.然后加入一定浓度的嘧啶和嘌呤继续培养2060分钟.置于低温(约20C)10分钟.离心洗涤 .用生理盐水或缓冲溶液制备菌悬液.,诱变,诱变剂的选择. 诱变处理方式.,突变株分离和筛选,微生物通过诱变因子处理,群体中产生各种突变体,其中有正突变 负突变和稳定型.需经过分离筛选,逐个挑出. 突变是随机不定向的,但筛选是定向的.筛选的条件决定选育方向.,常规筛选程序,第一次诱变:出发菌株 诱变分离在平皿上挑选菌落(200个) 初筛(1瓶/株) 选取50株复筛(35瓶/株) 选取35株(供下次做出发菌株). 第二次诱变:取上述菌株4株诱变分离到平皿上每株取100个菌落初筛(1瓶/株) 复筛选取35株供第三次诱变.,筛选方法,随机筛选:将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上,随机挑选菌落,逐个进行鉴定.其优点是不管种子或发酵条件如何,都能做到与大生产条件接近.缺点是效率低. 平板菌落预选法:根据菌种及其代谢产物的特性,在平板上设计许多巧妙的筛选方法和活性粗测方法.,平板菌落预选法,根据形态