细菌α淀粉酶产生菌种筛选.ppt

细菌-淀粉酶产生菌种筛选,一实验目的,1掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2巩固所学的微生物学实验技术。,二. 实验原理,-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。,从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。,1、采样：即采集含菌的样品,1）研究所筛选的微生物得可能分布区域。 2）土壤是微生物的大本营，所以一般采集土样。 3）土壤中，数量上细菌放线菌霉菌酵母菌。 4) 不同区域的土壤含有相应的优势微生物。例如树林腐土和朽木中纤维素分解菌较多；面粉厂附近、栽种淀粉质作物土壤中淀粉的分解菌较多；果实、树叶表面酵母菌较多；蔬菜、牛奶中乳酸菌较多；油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。,2、增殖培养（又称富集培养）,增殖培养就是在所采集的含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于采用稀释分离法分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。,3、纯种分离,在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。,最常用的分离方法是稀释分离法。,4、性能测定,分离得到纯种只是选种工作的第一步。所分离的纯种是否具有生产上要求的优良性能，还必须进行性能测定，根据性能高低进行取舍。,性能测定的方法,1）初筛：一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。 例如要筛选淀粉酶产生菌，可以在稀释分离时使用选择培养基含淀粉的培养基，经培养后通过测定透明圈与菌落直径的比值来衡量淀粉酶活力的高低。,2）复筛：在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养或固体培养，对培养物进行分析酶活性 测定。根据酶活性的大小，进一步对所分离的菌种进行挑选。,三实验材料,1、材料：小铁铲和无菌纸或袋。无菌水三角瓶（300mL的瓶装水至99mL，内有玻璃珠若干）；无菌吸管（1mL，5 mL等）；无菌水试管（每支4.5mL水）；无菌培养皿；,2、培养基,1）分离培养基（w/v）：蛋白胨 1%；NaCl 0.5%；牛肉膏 0.5%；可溶性淀粉 0.2%；琼脂1.5%；pH7.2；水定容。注：先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中，调匀。 2）肉膏蛋白胨培养基（w/v）：肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%, pH7.0-7.2 3）麸曲培养基：麸皮7克； 玉米面 1克； (NH4)2SO4 0.04克 (4%(NH4)2SO4加1mL)； NaOH 0.08克(8%NaOH加lmL)；水10mL，混合均匀，装入250-300mL三角瓶中，15磅灭菌30分钟。,3.试剂：,1）Lugol氏碘液：碘1克，碘化钾2克，水300毫升。 配制时先将碘化钾溶于5-10毫升水中，再加入碘，溶解后定容。 2）碘原液： 碘 2.2%； 碘化钾 4.4%； 加水定容。 3）比色稀碘液：碘原液2mL，加碘化钾20g，定容至500mL。现配现用。 4）0.2%可溶性淀粉液（w/v）：称取0.2克可溶性淀粉，先以少许蒸馏水混合，再徐徐倾入煮沸蒸馏水中，继续煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。 5）pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：Na2HPO412H20 11.31克，柠檬酸 2.02克，加水定容至250mL。,四实验方法,1、分离纯化 采集样品 样品稀释：在无菌纸上称取样品1g，放入100mL无菌水的三角瓶中，手摇10分钟。80水浴15分钟，冷却。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌水试管中，梯度稀释至10-6。 稀释分离：用稀释样品的同支吸管分别依次从10-4、10-3、10-2样品稀释液中，吸取1mL，注入无菌培养皿中，然后倒入灭菌并融化冷至50左右的固体培养基，小心摇动冷凝后，倒置于37温箱中培养24小时。,碘液检查：培养24小时后，取出平板，无菌操作向皿中注入1滴Lugol氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围有无色圈，说明该菌能分解淀粉。 菌种纯化：无菌操作从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种环沾取少量培养物至斜面上，并进行2-3次划线分离，挑取单菌落至斜面上，培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。,2、麸曲培养,取纯化菌落斜面中加入5mL无菌水制成菌悬液，取1mL接种至麸曲培养基中，搅匀后，36-37培养24小时。,3、酶活测定,制备酶液：在已成熟的夫曲三角瓶中，加水100mL，搅匀，置30水浴30分钟，用脱脂棉过滤，滤液即细菌-淀粉酶液。 酶活测定：在三角瓶中，加入0.2%可溶性淀粉溶液2mL，缓冲液0.5mL，在60水浴中10分钟平衡温度，加入3mL酶液，充分混匀，即刻记时，定时取出一滴反应液于比色板穴中，穴中先盛有比色稀碘液，当由紫色逐渐变为红棕色，即为反应终点，记录时间（t），单位为分钟。,酶活力单位的计算,淀粉酶活力单位的定义：1克或1mL酶制剂或酶液于60，在1小时内液化可溶性淀粉的克数 克/克(或毫升)小时。 淀粉酶活力单位=（60/t）20.2%f/3（f/t） 式中f是酶的稀释倍数。 注意事项： 淀粉液应当天配制使用，不能久贮。 测定液化时间应控制在23分钟内。,五实验报告,总结整个分离筛选过程，写出筛选结果并对筛选结果进行分析。,六. 实验时间安排,周一：配制培养基并灭菌、配制试剂；稀释分离，37培养24h。 周二：碘液检查，挑取透明圈直径：菌落直径比值大的单菌落，平板划线，37培养24h。 周三：挑取单菌落接斜面培养基。 周四：接麸曲培养基，37培养24h。 周五：测定酶活。,各组任务安排,一组：分离培养基2000mL。4.5mL无菌水60支。包扎1mL移液管10支 二组：肉膏蛋白胨培养基 。包扎1mL移液管10支。