人绒毛膜促性腺激素侧向层析检测试纸的研发.ppt

人绒毛膜促性腺激素侧向层析检测试纸的研发,学 院：生命科学学院 专 业：生物工程 报 告 人：段海婷,一、简介,人绒毛膜促性腺激素(HCG)是孕卵着床后由人体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，它是由和二聚体的糖蛋白组成，亚基与垂体分泌的FSH（卵泡刺激素）、LH（黄体生成素）和TSH（促甲状腺激素）等基本相似，而-HCG是HCG所特有的，HCG的含量变化已成为检测是否妊娠的重要依据。 市面上销售的HCG试纸被大家所熟悉，然而它只适用于一般人群，本试纸灵敏度进一步提高，也可适用于不易检测的人群。,二、检测原理,以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用金聚集呈现红色，检测抗原，检测结果一般有阴性和阳性。,试纸条主体示意图,试纸条阳性示意图,试纸条阴性示意图,三、实验方法与结果,1.金的选择,金在整个检测过程中起示踪的作用，其质量的好坏直接影响试纸的检测结果。 制备金一般使用的方法是用还原剂将氯金酸还原，制备金，其制备方法较多，本实验应用两种制备金的方法：柠檬酸钠法（水相）和硼氢化钠法（有机相）。,柠檬酸钠法,柠檬酸钠法制备的金在1-100纳米之间，能均一稳定的分散在液体中，由一个基础金核和外面的双离子层构成，分散溶液中的H+ 构成金的最外层离子层，在金核表面紧连的是内层离子（AuCl2-），来维持金的悬液状态。,硼氢化钠法,以硼氢化钠做还原剂，甲苯做溶剂，通过还原氯金酸制备得到金纳米粒子。这时金颗粒表面由十二硫醇做配位保护，巯基配位结合在金颗粒表面，碳链留在外面，此时的金纳米颗粒是疏水的。 两亲聚合物是既有疏水基团又有亲水基团的齿状聚合物，其通过疏水作用包裹在金纳米颗粒表面，从而使金纳米颗粒由有机相转移到水相。,柠檬酸钠法制备金的表征,水相金溶液晶莹透亮，无混浊，色泽鲜艳，呈酒红色， 没有漂浮物。水相金粒径18.16nm，水相金最大吸收峰在520nm时吸收值是0.41。,硼氢化钠法制备金的表征,上图的金成黑紫色，不浑浊，没有悬浮物，粒径为20.5nm，最大吸收峰在517nm时吸收值是0.19。,两种制金方法的对比结果,上图蓝色线是水相金紫外可见分光光度检测结果，粉色线是有机相相金紫外可见分光光度检测结果。两种方法制备出来的金颗粒粒径基本一致，两种方法最大的不同就是柠檬酸钠还原法制备的金的吸收值Abs在最高峰及最高峰之前一直偏大，这说明，柠檬酸钠还原法制备的金浓度大，更适合本实验后面金标抗体的制备。,2.金标抗体制备 金标抗体即金和抗体大分子结合物，金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合，不会影响蛋白质活性。 左边的最大吸收峰在277nm处，是没有结合的抗体蛋白；右边的最大吸收峰在527nm，比原来的520nm大，说明金结合了抗体蛋白，体积变大。,3.试纸材料的选择 把羊抗鼠二抗固定到A，B，C三种不同孔径的硝酸纤维素膜试纸同一位置处，将其37干燥后，在硝酸纤维素膜试纸的一端滴加金标抗体溶液，比较液体流速、是否会产生背景色，以及羊抗鼠二抗与金标抗体的结合效果。,A,B,B,B,C,C,4.膜抗体的固定,膜的选择固定：固定蛋白用硝酸纤维素膜，因为此膜和蛋白质有很强的结合力；连接垫用玻璃纤维素膜，因为其有化学惰性，可以成为的金标物暂时载体，有利于金标抗体的释放。,抗体,羊抗鼠二抗,金标抗体,5.试纸条的组装,试纸条由底板、样品垫 、连接垫 、 NC膜（检测线和质控线）和吸水纸组成。,6.试纸条阳性、阴性结果测试 在试纸条一端分别滴加含有和不含人绒毛膜促性腺激素抗原的溶液，待5min后样品渗移到试纸的另一端，观察结果。,上图左侧是阴性结果图，右侧是阳性结果图，可以看出检测结果明显，而且两侧的三条试纸检测结果一样，体现了本试纸的重复性好，说明结果可靠，没有偶然性。,试纸条灵敏度对比测试 将孕妇尿液稀释4倍，分别滴加于本实验的试纸和市面所卖试纸，待样品液渗移到试纸的另一端，观察结果。,上图是孕妇尿液稀释4倍后检测的结果对比图，左图是本实验制备试纸，右图是市面上所卖试纸，相同的检测原液不同的检测结果。可以看出