实验Arabidopsis叶片总RNA的提取及浓度测定.ppt

Arabidopsis 叶片总RNA的提取及浓度测定,RNAiso Plus是广谱型Total RNA提取试剂。实验操作快速方便，颜色鲜明，便于分层。 本制品可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取Total RNA。样品在RNAiso Plus中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（鲜红色下层），RNA分布在上层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。,Takara RNAiso Plus,RNA extraction from Arabidopsis leaves,RNAiso Plus具有以下特性： 1. 广谱性强。可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取Total RNA。 2. 纯度俱佳。提取的Total RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。 3. 快速简便。实验操作快速方便，整个操作在一小时内便可完成。 4. 颜色鲜明。加入氯仿离心后，会形成无色的上清层和鲜红色的下层（有机层）。,RNA提取实验前的准备 RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1） 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37下处理12小时。 （2） 然后在120下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。 RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。,【试剂配制】 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180，60分钟）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。 RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。,实验操作,1. RNAiso Plus的使用量情况如下,2. 实验样品的研磨和匀浆,A. 贴壁培养细胞 倒出培养液，用1PBS清洗一次。 每10 cm2生长的培养细胞中加入1 ml的RNAiso Plus，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于 细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥 离细胞）。 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 室温静置5分钟。,B. 悬浮培养细胞 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4离心2分钟，弃上清。 向每107个细胞中加入l2 ml的RNAiso Plus。 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 室温静置5分钟。,C. 动物组织、植物材料样品 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。 对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Plus的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。 将粉末用药勺转移至离心管中，加入1ml RNAiso Plus,室温静置5分钟。 12,000 g 4离心5分钟。 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。,3. Total RNA的提取。 向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5分钟。 12,000 g 4离心15分钟。 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在1530下静置10分钟。 12,000 g 4离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出 现沉淀。,4. RNA沉淀的清洗。 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75的乙醇1 ml（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。 5. RNA的溶解。 室温干燥沉淀25分钟（不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明），加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80保存。,RNA提取操作流程图,从植物组织中提取Total RNA 使用本试剂盒从马铃薯块根、香菇子实体、烟草叶片、水稻叶片、芒果果实、花生果实等组织中提取了Total RNA，电泳结果见图2。,RNA extraction from Arabidopsis leaves,Troubleshooting,1. 有关RNA的吸光度说明如下： 260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD28O（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.82.2之间，当R2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。 在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer。 2. 如何计算RNA的浓度？ RNA浓度=（OD260-OD320）稀释倍数0.04 g/l。 3. 提取的RNA中含有多糖怎么办？ 大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去，使用此类组织材料提取RNA时，建议增加RNAiso Plus的使用量、采用LiCl沉淀的方法或按照下述方法进行：向裂解液中加入氯仿离心分层后，抽提水相中的RNA，向水相中加入0.25 ml的异丙醇（每使用1 ml RNAiso Plus），再加入0.25 ml的盐溶液（0.8 M柠檬酸钠，1.2 M氯化钠）轻轻反复颠倒数次混匀。室温静置5分钟后，4 12,000 g离心10分钟（替代原来异丙醇沉淀，后续步骤相同）。但此方法会失大量RNA，导致收量降低，small RNA的损失尤其严重。,4. 一些富含多糖多酚的植物材料，按照上述方法仍无法有效提取出RNA，怎么办？ 可以搭配使用RNAiso-mate for Plant Tissue（TaKaRa Code：D325）进行提取，如香蕉果实、松树针叶等特殊组织材料均可以使用这种方法有效地进行提取。若提取的结果仍不满意，可以使用RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue（TaKaRa Code：D326）提取。 5. RNA提取量较低怎么办？ 向组织材料中加入RNAiso Plus后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。 相分离后请尽量完全回收上清液。 6. 提取的RNA不溶怎么办？ 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。 可以于60加热5分钟后再于冰上溶解数小时。 RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，避免枪头接触蛋白层。 溶解液更换为0.5%的SDS溶液（DEPC处理水配制）。,7. OD260/OD280值1.65，为什么？ RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD 0值升高。 样品裂解时加入的RNAiso Plus量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。 RNA未充分溶解。 8. 提取的RNA降解，为什么？ 使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80保存。 提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Plus的添加量不够。 9. 提取的RNA中含有DNA污染，为什么？ 裂解组织或细胞使用的RNAiso Plus量偏少。 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等）、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。 如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用DNase I（RNase Free；TaKaRa Code：D2215）进行DNA消化。,拟南芥 一把打开植物生命奥秘大门的钥匙,拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科，与白菜、油菜、甘蓝等经济作物同属一科。拟南芥本身并无明显的经济价值，可以说只是路边的“野草”，但在过去二十年中，它越来越多地被作为一种模式生物加以研究。拟南芥的全基因组测序工作于2000 年完成，成为植物界第一个被完整测序的物种。与其他一些高等植物相比，拟南芥的基因组很小，5 条染色体总共含约1.15 亿个碱基对，这与水稻4.3 亿、玉米24 亿、小麦160 亿个碱基对相比，形成巨大的反差。尽管基因组小，拟南芥的2.5万多基因在功能类别上却和其他开花植物大致相似，因而，拟南芥作为实验材料有利于其基因的克隆和饱和突变体库的建立。此外，拟南芥生命周期很短，从播种到种子收获仅需要68 周；拟南芥个体较小，适合于实验室内种植。所有这些都使得拟南芥成为一种特别理想的遗传学和分子生物学研究材料，广泛用于植物生命奥秘的研究探索。,/,在自然界中，拟南芥主要分布于温带，集中在欧洲地区；在东非、亚洲大陆、日本也都有分布，一般生长在野外干燥的土壤中。欧洲文明的扩张把拟南芥带到了北美和澳洲大陆。历史上对拟南芥科学研究的记载最早可追溯至16 世纪，由德国学者Thal在德国北部的哈茨山区中首次发现并记录了这个物种。19 世纪分类学家Heynhold 将其命名为Arabidopsis thaliana。现在人们在世界各地共收集到750 多个拟南芥生态型，这些生态型在形态发育、生理反应方面存在很大差异。在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是Landsberg erecta(Ler)、Columbia(Col)、Wassilewskija(Ws)，其中Col 生态型用于拟南芥的全基因组测序。,History,在1873 年，Braun 报道了他在柏林郊外发现的一种拟南芥突变体，这可能是拟南芥研究历史中所发表的最早一项在分类学之外的研究工作。他当时所发现的这个突变体极有可能就是植物科学研究领域中为人们所熟知的AGAMOUS(AG)基因的突变体，这个基因是花发育ABC 模型中的C 类基因。Meyerowitz 实验室于1990 年报道了对AG 基因的克隆。之后，另一个值得注意的工作是Laibach 在1907年首次报道的对拟南芥染色体的研究并最终确定了拟南芥具有5 条染色体。Laibach 于1943 年详细阐述了拟南芥作为模式生物的优点，并在他之后的工作中大力推动了对拟南芥的研究。在Laibach和其他一些科学家的共同努力下，促成了1965年在德国哥廷根召开的第一届国际拟南芥会议。,20 世纪80 年代，分子生物学技术的迅猛发展，给植物科学研究带来了巨大的机遇。1986 年，Meyerowitz实验室首次报道了对拟南芥中一个基因的克隆。同年，Horsch 实验室报道了根癌农杆菌介导的T-DNA 对拟南芥进行的遗传转化。1988 年，Meyerowitz实验室发表了拟南芥基因组的首个RFLP 图谱。在之后的几年中，相继报道了T-DNA 插入突变基因的克隆、基于基因组图谱的基因克隆。这些突破使人们逐渐认识到拟南芥作为实验材料对植物生命进行探索的价值。,拟南芥研究的主要策略,在拟南芥研究中，使用最多的是遗传学研究策略，包括正向遗传学和反向遗传学。正向遗传学遵循的是从突变体表型分析到基因功能认识的思维方式，它首先关注的是具有某种缺陷的突变体。譬如，如果要研究与植物抗旱机理有关的基因调控过程，可以先用化学、物理或者生物的方法将野生型拟南芥诱变，然后在干旱胁迫的条件下进行突变体的筛选。如果在诱变群体后代中出现了对干旱条件反应不同于野生型的个体(例如比野生型更加抗旱或者不抗旱的植物)，这种个体就是突变体。这种植物对干旱的不同反应可能就是因为突变体中某一个基因遭破坏后所造成，而这个基因必定与植物的抗旱机制有关。在得到了这样的一个突变体之后，可以对其中的突变基因进行定位和克隆。在获得了基因序列后，可以更深入地了解这个基因的功能，并分析它是以何种形式影响了植物的抗旱途径以及与抗旱途径中其他相关基因的关系。,对正向遗传学来说，突变表型是所有研究工作的起点。如果一个基因突变之后没有显著的表型改变，那它的突变体也就很难在筛选过程中被发现。因此，正向遗传学不适用于研究这类基因。事实上，拟南芥中有许多基因都存在功能上的冗余性，即某些基因在功能上可以部分互相替代，其中一个基因的突变往往不会产生十分明显的表型变化。这些基因在蛋白质序列上也往往会存在着很高的同源性，通常把它们称为一个基因家族。据估计，拟南芥有65% 的基因可以归并到某个家族中，这意味着相当一部分基因可能无法通过正向遗传学来揭示它们的主要功能，需要反向遗传学的介入。,反向遗传学是在已知某个特定基因序列的前提下去探索这个基因的功能。例如，可以利用已知的基因序列构建该基因的反义RNA 或者双链RNA 结构，用这样的构建去转化野生型植物。这种构建在植物中有可能干扰其内源基因的表达，甚至干扰该基因所在的家族基因的表达。根据一些基因受到干扰后出现的表型，可以推测这个基因或者与其同源的基因的功能。此外，反向遗传学研究还可以用在不同时空表达的启动子来驱动已知序列基因的表达，研究该基因过量表达或者时空异位表达时的植物表型，推测该研究基因的功能。,Some of its advantages as a model organism: It has one of the smallest genomes in the plant kingdom: 115,409,949 base pairs of DNA distributed in 5 chromosomes (2n = 10). Very little of this is “junk“ DNA so most of the DNA encodes its 25,498 genes. Transgenic plants can be made easily using Agrobacterium tumefaciens as the vector to introduce foreign genes. The plant is small a flat rosette of leaves from which grows a flower stalk 612 inches high. It can be easily grown in the lab in a relatively small space. Development is rapid. It only takes 5 6 weeks from seed germination to the production of a new crop of seeds. It is a prolific producer of seeds (up to 10,000 per plant) making genetics studies easier. Mutations can be easily generated (e.g., by irradiating the seeds or treating them with mutagenic chemicals). It is normally self-pollinated so recessive mutations quickly become homozygous and thus expressed.,A 改良的热酚法提取植物的RNA,一、RNA实验前的准备,1了解RNA的特征 RNA是单链分子，由A,U,C,G四个碱基串联在核糖磷酸骨架上而成为多核苷酸链由于核糖位是OH，遇水易发生变构，使其结构很不稳定，这种不稳定的变构反应在碱性条件下被加快因此，RNA的长期保存是一件头疼的工作不合适的缓冲液将大大缩短保存时间，RNA的完整性也受到严重破坏 细胞外存在大量RNA酶（RNase），对RNA产生降解反应，而且该酶极稳定，因此，在RNA提取和分析过程中，要时刻注意如何避免RNase污染（RNA降解） pH6.0微酸性环境下RNA相对稳定，碱性条件下易分解,树立RNase-free思想 ）RNase无处不在细胞内含有大量的RNase,裂解细胞时应特别注意；人的体液中含有大量的RNase,应尽量避免样品或样品管与体液的接触，空气中的灰尘与细菌中含有大量的RNase,应建立干净的操作环境 ）RNase稳定性极高运用蛋白质变性剂SDS或苯酚不能使之完全失活；其活性不依赖金属离子，因此EDTA等螯合剂不能使之失活；热稳定，仅用煮沸方式不能使之失活 ）创造良好的实验环境尽量使用一次性用品或专用品，尽量同时使用RNAse的抑制剂，保持实验场所器械试剂储存场所的清洁,器皿与试剂的准备,）RNAse去除剂RNase在强碱条件下易失活利用该性质生产的RNase去除剂已经商品化； ）干热灭菌用于玻璃器皿，金属及耐250物品的灭菌 烤箱中小时以上 ）高温高压灭菌用于一次性使用的塑料制品的灭菌，灭菌时间为h. 4) DEPC处理提取RNA所用的所有玻璃器皿及吸头，离心管，均用DEPC水室温浸泡过夜，高压灭菌。 所用试剂除Tris-HCl外，均用DEPC水配置，室温过夜，高压灭菌。Tris-Cl则用DEPC处理过的无菌水高压灭菌后配置，然后再次高压灭菌备用。,1) 在离心管中，将4ml提取缓冲液（用前加入PVP及-巯基乙醇）与4ml酚-氯仿混合，置于65水浴锅中温浴。 2) 取棉花组织1-2克置于液氮中研磨至碎末，转入装有提取缓冲液及酚-氯仿混合液的离心管中。涡旋30s 3) 在高速冷冻离心机内4离心，12000rpm 15分钟，将上清移至另一离心管中加入4ml酚-氯仿混合液，混匀，离心。重复该操作一到两次。然后取上清。 4) 加入等体积（大约3.6体积）的4mol/L的LiCL混匀，20放置至少2小时。12000rpm 离心20分钟。 5) 倒掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀，然后将沉淀悬浮于0.5ml的TE中。将混合液转入1.5ml的离心管中。,Procedure,在高温下进行酚处理，能有效地使RNase失活，而且改善蛋白质变性效果，提高酚的分离能力,6) 加入等体积的酚-氯仿混合液抽提一到两次。将上清转入另一离心管中，加入1/10体积3mol/LNaAc(pH 5.3)和2-3倍体积的无水乙醇20放置1-2小时。 7) 12000 rpm 4 离心15分钟，用70%乙醇洗涤沉淀，室温放置2-3分钟。 加200-500l的DEPC水，悬浮沉淀，80保存备用,B CTAB法提取植物RNA,提取缓冲液中的CTAB 是一种较强的去污剂,对蛋白的变性效果明显强于SDS。同时,先用LiCl 选择性沉淀总RNA ,然后再用酸酚-氯仿抽提使水相中残留的少量DNA 溶于有机相,从而可以最大限度地消除总RNA 中的DNA。提取缓冲液中高浓度的NaCl 有利于去除多糖污染 ,LiCl 也可以使部分多糖留在溶液中而不随RNA沉淀下来 ,这样极大地降低了沉淀中多糖的含量。我们测定了不同样品的A260PA280 ,其数值均在1. 902. 0 左右,基本上没有蛋白和DNA等杂质的污染.,1) 取1 g 左右的棉花新鲜幼嫩组织,加液氮充分研磨呈粉末状,及时转移到10 ml 离心管中; 2) 加5 ml 的提取缓冲液(1. 4 mol/L NaCl ,0. 1 mol/L Tris HCl , pH8. 0 ,20 mmol/L EDTA , 2 % CTAB , 2 % PVP , 1 %2巯基乙醇) , 振荡混 匀,65 水浴约20 min , 中途混和2 3 次, 使 RNA 充分析出; 3) 加0. 6 倍体积的氯仿,充分混 匀,然后冰浴静置10 min ; 4) 4 ,8 000 rpm 离心 20 min ,将上清液转移到另一新10 ml 离心管中; 5) 加入1P3 倍体积的8 molL 21 LiCl 溶液,混匀冰浴静置68 h ; 6) 4 ,8 000 rpm 离心20 min ,弃去上部溶液,沉淀用70 %乙醇洗涤1 次,并转 移到2 ml 离心管中; 7) 5 000 rpm 离心5 min ,吸 去乙醇溶液, 将沉淀真空抽干;,Procedure,8 ) 加2 ml 的H2ODEPC溶解沉淀,并将溶液分装入两个2 ml 离心管中; 9) 每管中加0. 8 ml 的酸酚P氯仿(11) ,混和均匀,然后室温静置5 min ; 10) 4 ,12 000rpm 离心20 min ,将上清液转移到另一新的2 ml离心管中,再重复步骤(9) (10) 12 次; 11) 上清液加0. 8 ml 氯仿抽提1 次;12) 上清液加入1P10 倍体积3 mol/LNaAc (pH5. 2) 溶液和1 倍体积预冷的异丙醇,-20 放置过夜; 13) 4 ,12 000rpm 离心20 min , 收集RNA 沉淀; 14) 沉淀用70 %乙醇洗涤2 次, 真空抽干后加入50l 的H2ODEPC ,充分溶解,取1l 电泳检测RNA 质量,其余RNA 于-80 保存。,C Trizol 试剂提取植物组织RNA,During sample homogenization or lysis, TRIZOL Reagent maintains the integrity of the RNA, while disrupting cells and dissolving cell components. Addition of chloroform followed by centrifugation, separates the solution into an aqueous phase and an organic phase. RNA remains exclusively in the aqueous phase. After transfer of the aqueous phase, the RNA is recovered by precipitation with isopropyl alcohol. After removal of the aqueous phase, the DNA and proteins in the sample can be recovered by sequential precipitation (2). Precipitation with ethanol yields DNA from the interphase, and an additional precipitation with isopropyl alcohol yields proteins from the organic phase (2). Copurification of the DNA may be useful for normalizing RNA yields from sample to sample.,This technique performs well with small quantities of tissue (50-100 mg) and cells (5 106), and large quantities of tissue (1 g) and cells (107), of human, animal, plant, or bacterial origin. The simplicity of the TRIZOL Reagent method allows simultaneous processing of a large number of samples. The entire procedure can be completed in one hour. Total RNA isolated by TRIZOL Reagent is free of protein and DNA contamination. It can be used for Northern blot analysis, dot blot hybridization, poly (A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning.,For use in the polymerase chain reaction (PCR*), treatment of the isolated RNA with amplification grade DNase I (Cat. No. 18068) is recommended when the two primers lie within a single exon. TRIZOL Reagent facilitates isolation of a variety of RNA species of large or small molecular size. For example, RNA isolated from rat liver, electrophoresed on an agarose gel, and stained with ethidium bromide, shows discrete bands of high molecular weight RNA between 7 kb and 15 kb in size, (composed of mRNAs and hnRNAs) two predominant ribosomal RNA bands at 5 kb (28S) and at 2 kb (18S), and low molecular weight RNA between 0.1 and 0.3 kb (tRNA, 5S). The isolated RNA has an A260/A280 ratio 1.8 when diluted into TE.,Precautions for Preventing RNase Contamination: RNases can be introduced accidentally into the RNA preparation at any point in the isolation procedure through improper technique. Because RNase activity is difficult to inhibit, it is essential to prevent its introduction. The following guidelines should be observed when working with RNA Always wear disposable gloves. Skin often contains bacteria and molds that can contaminate an RNA preparation and be a source of RNases. Practice good microbiological technique to prevent microbial contamination. Use sterile, disposable plasticware and automatic pipettes reserved for RNA work to prevent cross-contamination with RNases from shared equipment. For example, a laboratory that is using RNA probes will likely be using RNase A or T1 to reduce background on filters, and any nondisposable items (such as automatic pipettes) can be rich sources of RNases., In the presence of TRIZOL Reagent, RNA is protected from RNase contamination. Downstream sample handling requires that nondisposable glassware or plasticware be RNase-free. Glass items can be baked at 150C for 4 hours, and plastic items can be soaked for 10 minutes in 0.5 M NaOH, rinsed thoroughly with water, and autoclaved. Other Precautions: Use of disposable tubes made of clear polypropylene is recommended when working with less than 2-ml volumes of TRIZOL Reagent. For larger volumes, use glass (Corex) or polypropylene tubes, and test to be sure that the tubes can withstand 12,000 g with TRIZOL Reagent and chloroform. Do not use tubes that leak or crack. Carefully equilibrate the weights of the tubes prior to centrifugation. Glass tubes must be sealed with parafilm topped with a layer of foil, and polypropylene tubes must be capped before centrifugation.,INSTRUCTIONS FOR RNA ISOLATION: Caution: When working with TRIZOL Reagent use gloves and eye protection (shield, safety goggles). Avoid contact with skin or clothing. Use in a chemical fume hood. Avoid breathing vapor. Unless otherwise stated, the procedure is carried out at 15 to 30C, and reagents are at 15 to 30C. Reagents required, but not supplied: Chloroform (氯仿） Isopropyl alcohol （异丙醇） 75% Ethanol (in DEPC-treated water) RNase-free water or 0.5% SDS solution （To prepare RNase-free water, draw water into RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v). Let stand overnight and autoclave. The SDS solution must be prepared using DEPC-treated, autoclaved water.,1. HOMOGENIZATION (see notes 1-3) a. Tissues Homogenize（匀浆） tissue samples in 1 ml of TRIZOL Reagent per 50-100 mg of tissue using a glass-Teflon or power homogenizer (Polytron, or Tekmars TISSUMIZER or equivalent). The sample volume should not exceed 10% of the volume of TRIZOL Reagent used for homogenization. b. Cells Grown in Monolayer Lyse cells directly in a culture dish by adding 1 ml of TRIZOL Reagent to a 3.5 cm diameter dish, and passing the cell lysate several times through a pipette. The amount of TRIZOL Reagent added is based on the area of the culture dish (1 ml per 10 cm2) and not on the number of cells present. An insufficient amount of TRIZOL Reagent may result in contamination of the isolated RNA with DNA. c. Cells Grown in Suspension Pellet cells by centrifugation. Lyse cells in TRIZOL Reagent by repetitive pipetting. Use 1 ml of the reagent per 5-10 106 of animal, plant or yeast cells, or per 1 107 bacterial cells. Washing cells before addition of TRIZOL Reagent should be avoided as this increases the possibility of mRNA degradation. Disruption of some yeast and bacterial cells may require the use of a homogenizer.,OPTIONAL: An additional isolation step may be required for samples with high content of proteins, fat, polysaccharides or extracellular material such as muscles, fat tissue, and tuberous parts of plants. Following homogenization, remove insoluble material from the homogenate by centrifugation at 12,000 g for 10 minutes at 2 to 8C. The resulting pellet contains extracellular membranes, polysaccharides, and high molecular weight DNA, while the supernatant contains RNA. In samples from fat tissue, an excess of fat collects as a top layer which should be removed. In each case, transfer the cleared homogenate solution to a fresh tube and proceed with chloroform addition and phase separation as described.,2. PHASE SEPARATION Incubate the homogenized samples for 5 minutes at 15 to 30C to permit the complete dissociation of nucleoprotein complexes. Add 0.2 ml of chloroform per 1 ml of TRIZOL Reagent. Cap sample tubes securely（盖紧样品管盖）. Shake tubes vigorously by hand for 15 seconds（用手晃动样品管秒） and incubate them at 15 to 30C for 2 to 3 minutes. Centrifuge the samples at no more than 12,000 g for 15 minutes at 2 to 8C. Following centrifugation, the mixture separates into a lower red, phenol-chloroform phase, an interphase, and a colorless upper aqueous phase. RNA remains exclusively in the aqueous phase. The volume of the aqueous phase is about 60% of the volume of TRIZOL Reagent used for homogenization.,3. RNA PRECIPITATION Transfer the aqueous phase to a fresh tube, and save the organic phase if isolation of DNA or protein is desired. Precipitate the RNA from the aqueous phase by mixing with isopropyl alcohol. Use 0.5 ml of isopropyl alcohol per 1 ml of TRIZOL Reagent used for the initial homogenization. Incubate samples at 15 to 30C for 10 minutes and centrifuge at no more than 12,000 g for 10 minutes at 2 to 8C. The RNA precipitate, often invisible before centrifugation, forms a gel-like pellet on the side and bottom of the tube.,4. RNA WASH Remove the supernatant. Wash the RNA pellet once with 75% ethanol, adding at least 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRIZOL Reagent used for the initial homogenization. Mix the sample by vortexing and centrifuge at no more than 7,500 g for 5 minutes at 2 to 8C.,5. REDISSOLVING THE RNA At the end of the procedure, briefly dry the RNA pellet (air-dry or vacuum-dry for 5-10 minutes). Do not dry the RNA by centrifugation under vacuum. It is important not to let the RNA pellet dry completely as this will greatly decrease its solubility. Partially dissolved RNA samples have an A260/280 ratio 1.6. Dissolve RNA in RNase-free water or 0.5% SDS solution by passing the solution a few times through a pipette tip, and incubating for 10 minutes at 55 to 60C. (Avoid SDS w