《光生物物理学》PPT课件.ppt

,荧光分光光度术 荧光与荧光光谱 荧光分光光度术 荧光分光光度计与影响荧光测量的因素 应用 生物大分子的能量与能量转移 蛋白质与核酸的能量状态 生物大分子中的能量转移 单分子生物物理,荧光分光光度术,第一节 荧光与荧光光谱,传递途径,荧光,延迟荧光,磷光,辐射跃迁,无辐射跃迁,系间跨越,内转移,外转移,振动弛豫,1、基态 一个分子在未吸收光能前所处的最低能量状态，叫基态。 2、激发态 当吸收光能后分子就会使一个电子提高到高能量轨道，这种能量提高的状态叫做电子激发态，简称激发态。有最低的电子激发态叫第一激发态；有较高的电子激发态分别叫做第二、第三激发态等等。第二、第三激发态可将多余能量以热能释放并降到第一激发态。,3、单线态 当吸收光子处于激发态时，虽然能量提高了，但电子自旋方向并没有改变，这时的激发态仍然是单线态。 4、三重态 指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的 电子之一自旋方向 改变，以至电子自 旋之和不为0的情况。,驰豫过程：吸收光能后分子处于激发态，处于激发态的分子可以通过多种途径，将多余的能量释放，使分子又回到稳定的基态，这些释放多余能量的过程就是驰豫过程。,5、驰豫过程,内转换：当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，如第一激发单重态的较高能级与第二激发态单重态的某一较低能级位能相同会发生电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上，称为内转换，转换速度10-1310-11 S（快）。,5、驰豫过程,系间跨越：指激发单重态与三重态之间的无辐射跃迁，原因：激发态电子自旋反转，造成多重复改变，可能单重态（S1）低振动能级与三重态T1的较高振动能量有重叠。,5、驰豫过程,外转换（猝灭）：激发分子与溶剂分子或其它溶液分子相互作用，发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失现象称为猝灭。,5、驰豫过程,荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光称为荧光。 磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光，则称这种光为磷光。,5、驰豫过程,荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光。 磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光。 荧光与磷光的产生过程：激发态基态的能量传递途径： 荧光：10-710-9 s，第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410s，第一激发三重态的最低振动能级基态；,光谱红移：任一物质的荧光光谱及其峰位的波长总是比它的吸收光谱及峰位波长要长，这现象称为光谱红移。 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,1、荧光光谱,2、荧光光谱与吸收光谱,镜像规则 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,第二节 荧光分光光度术,1、荧光强度（F）,其中，F：荧光强度， （1）：物质的发光本领， 0 ：荧光量子效率，Ia：吸收光强度。,由Lambert-Beer定律：,其中：I0为入射光强，I为透射光强。,代入,则有：,当c很低时，,当c很大时，,1、荧光强度（F）,样品的浓度大，荧光就强（10-410-7mol/l）； 浓度超过10-3mol/l后，浓度愈大荧光反而愈小（浓度猝灭现象）。,2、荧光光谱 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种： 激发谱：表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长荧光强度的变化。以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标画出的曲线即为荧光激发光谱，简称激光光谱。 激光谱说明哪种激发光波长荧光效率最高。激发光波长往往与该物质的吸收光谱中的峰位波长一致。,2、荧光光谱 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种： 发射谱: 是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。,2、荧光光谱,发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量（如能级图2 ，1），产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光（如2）。,3、荧光偏振,荧光偏振：荧光物质发出的荧光，其电场矢量方向介于自然光和偏振光之间，是部分偏振光。这一现象称为荧光偏振（又称荧光去偏振） 。,3、荧光偏振,荧光偏振,3、荧光偏振,荧光偏振度（P）：荧光偏振的程度。,其中： V（vertical）垂直，H（horizontal）水平。IVH，入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测得的荧光强度。,3、荧光偏振,荧光偏振度（P）的物理意义,时，P=0，类似自然光，荧光分子运动很快，取向随机。（稀溶液）,时，P=1，平面偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。,时，0P1，部分偏振光。生物大分子属于此种情况。,4、荧光寿命 定义：荧光强度衰减到原来的1/e所需要的时间，称为荧光寿命（）。,其中，I0为激发时最大荧光强度，It为时间t时的荧光强度，k为衰减常数。,荧光强度的衰减符合指数衰减的规律,5、荧光探剂,生物化学中主要的可分为两类。,5、荧光探剂,荧光物质：通常都具有环状共轭双键（）,天然生物分子：的只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿素和NADH等少数分子。,蛋白质：只有含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸时才具有荧光特性。,核酸：除碱基外也不发荧光。,脂质（脂组成的膜系统）：无荧光特性。,5、荧光探剂,天然荧光生色团结构特点,碳原子骨架,分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环,任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率。如：对苯基化，间苯基化等。,5、荧光探剂,天然荧光生色团结构特点,分子的几何排布,具有刚性平面结构,5、荧光探剂,天然荧光生色团结构特点,取代基的类型,加强荧光的基团：给电子取代基，如，-NH2、 -NHR、 -OH、-OR、 -CN、-OCH3、-OC2H5,减弱荧光的基团：得电子取代基，如，-CO2H、-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-SH、-F、-Cl、-Br、-I,影响不明显的基团：-R、-SO3H、-NH3,5、荧光探剂,天然荧光生色团结构特点,取代基的位置,邻位、对位荧光增强,间位荧光减弱（-CN基例外）,5、荧光探剂,蛋白质和核酸中的荧光生色团,5、荧光探剂,荧光探剂（针）,荧光探剂（针）：根据小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为。,荧光标记：利用荧光探剂标记到无荧光的分子或系统内，以研究后者的特性，这种方法称为荧光标记。,5、荧光探剂,荧光探剂（针）分子的基本要求 能产生稳定、较强的荧光； 探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固； 探针的荧光必须对环境条件比较敏感； 结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。,5、荧光探剂,荧光探剂（针）的应用分类,测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针。,膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针，其它非极性和双亲性膜探针。,细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针 。,离子荧光探针：Ca2、 Mg2、Zn2 、Na、 K， Cl-等。,5、荧光探剂,荧光探剂（针）的应用分类,pH荧光探针：近中性pH应用的探针、酸性、探针交联物。,活性氧和一氧化氮探针,细胞骨架蛋白荧光探针,信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针,入胞作用、受体和离子通道探针,细胞形态和流体测量的荧光示踪剂,第三节 荧光分光光度计及影 响荧光测量的因素,入射的激发光与荧光探测方向垂直，可避免入射光的干扰，也有采用90o以外方向夹角。,光源：氙灯（200800nm）、高压汞灯、一些频率可调的激光器,波长选择器：常采用光栅或滤光片作为波长选择器件,样品池：用去除荧光物质的石英玻璃制成的矩形或正方形杯，四面透明,检测器： 200600nm光电倍增管，也有对红光比较敏感的光电倍增管。,1、结构,荧光测量样品可以是液态、固态或凝聚态。,2、样品,液体样品采用普通的样品杯和样品架，测量时采用透射模式；,固体样品需要采用固体样品架，测量时的几何配置模式不仅不是透射模式，还要避免入射光直接通过样品反射进入监测器；,凝胶态样品，可以根据样品的透明程度决定采用液体样品架或固体样品架。,1、光化分解,物质吸收光能后，会使化学键断裂，从而产生光化分解，导致荧光减弱。 保存在棕色瓶中，样品光照后，立即进行测量。,荧光测量样品可以是液态、固态或凝聚态。,2、淬熄（淬灭）,温度淬灭：温度升高，分子运动加速，分子间的相互碰撞几率增加，使处于激发态的分子能量以热能方式释放。,浓度淬灭：溶质对荧光的猝灭效应是多种多样的，就其产生的机制而言，有能量转移、碰撞以及发光（生色）团形成络合物等等。,2、淬熄（淬灭） 浓度淬灭：,荧光由于能量转移而产生的猝灭，是指溶质与荧光团之间的距离小于100之内，而两者的波长关系又符合在满足能量转移所需要的条件时所产生的能量非辐射共振转移。 溶质与荧光团发生碰撞产生的荧光猝灭是最通常 的一种猝灭（动态猝灭）。 溶质与荧光团形成络合物，从而使荧光团的荧光猝灭，这种猝灭叫做静态猝灭。,2、淬熄（淬灭） 杂质淬灭：,由于杂质的存在使荧光强度下降的现象。,3、溶剂的极性及pH 溶剂对荧光的影响叫溶剂效应，它是影响荧光团荧光光谱位移的重要因素。,3、溶剂的极性及pH 溶剂的极性：,非极性溶剂中，荧光分子吸收光能从基态跃迁到激发态，分子的取向没有改变。,极性溶剂中，荧光分子吸收光能发生跃迁时，受到溶剂的影响，其分子将重新取向，这一过程将丢失能量。,荧光物质在非极性溶剂中的发射峰位比其在极性溶剂中的峰位向短波方向（高频率）移动，即蓝移。同时荧光强度前者也高于后者。,3、溶剂的极性及pH 溶剂的极性：,1，6-二苯基-1，3，5-三己烯（DPH）,3、溶剂的极性及pH pH,利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变，可以判别各种滴定的终点。,第四节 荧光分光光度术的应用,用微管抗体标记的细胞，用BODIPY-FL（绿色），Texas-Red-X Phallioidin（红色）和DAPI（蓝色）修饰的二次抗体观察细胞的共聚焦切片。采用63 x，1.4 NA油浸物镜。A, UltraView ERS间行/列扫描型数码相机；B, UltraView ERS电子倍增型数码相机。插图为10m方框的放大图，图中标尺：10m。,首例“绿色荧光蛋白转基因”克隆猪顺利降生,1、荧光物质检测,测量原理：,非极性溶剂中，荧光分子吸收光能从基态跃迁到激发态，分子的取向没有改变。,当c很低时，,结构特点：含有“芳香环”结构,灵敏度：10-710-8g/ml（比吸收光谱高1000倍）,测定牛奶中的蛋白质含量：蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。它们的荧光强度为100：9：0.5。采用280nm的激发波长，发射波长范围在340350nm进行蛋白天然荧光的检测。,氨基酰化酶在0.6mmol/L十二烷基硫酸锂作用下 内源荧光反射谱（激发波长295nm）随时间变化,1、荧光物质检测,蛋白质中苯丙氨酸（酪氨酸）,ex：365nm em：515nm,茚三酮（Cu2+，pH5.8）+ Phe,1、荧光物质检测,蛋白质中非荧光氨基酸,荧光胺：非荧光试剂，在温和条件下与氨基酸或多肽中的氨基反应形成稳定的发荧光的复合物。可用于氨基酸、蛋白质及酶水解蛋白的荧光测定试验 （5pmol/l）。,1、荧光物质检测,检测微量抗原或药物,荧光偏振与免疫学方法结合免疫荧光偏振法,原理：利用生物大分子体系荧光偏振度P的大小与分子的大小成正比关系，以及抗原、荧光标记抗原与抗体结合而形成的一种技术。,结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。,2、酶反应动力学,NADH： ex：340nm ；em：450nm,测定乳酸盐浓度：固定NAD和乳酸脱氢酶浓度，加入不同浓度乳酸盐，测一定t内的F，作F / t对乳酸盐浓度的曲线标准曲线。,乳酸脱氢酶活性或浓度,3、生物大分子的结合研究,生物大分子构象,氨基酸或发光基团所处环境：疏水、亲水、极性大小。,蛋白质构象：酶活性中心位置或环境,3、生物大分子的结合研究,分子结合Scatchard图,设，P为蛋白质（大分子）浓度，L为小分子（配体）浓度，n为每个大分子上能与L结合的位点数，r为每克分子P已经结合的L的摩尔数及结合百分数，Ka为结合常数。,3、生物大分子的结合研究,分子结合Scatchard图,P + L LP,令结合位点被占据的比例为r,或,3、生物大分子的结合研究,分子结合Scatchard图,设P上存在n个结合位点，每个结合位点的结合常数相同，且彼此相互作用，则：,此时，,3、生物大分子的结合研究,分子结合,如，杀鼠灵的ex：320nm，em：400nm；量子产率=0.012。与人血清蛋白结合后em蓝移10nm，=0.090。,设，饱和值的荧光强度为b，在曲线上任取一点，其纵轴为a，此处的结合百分数r=a/b，横坐标为L0/P0，故与r相对应的L= L0- LP= L0-rP0,生物大分子的能态与能量转移,第一节 蛋白质与核酸的 能量状态,1、蛋白质的能态,芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸,肽键荧光：em 200220 nm,硫酯键：em 235250 nm,1、蛋白质的能态,无芳香氨基酸的蛋白质一般无荧光,A类蛋白质：不含色氨酸而含酪氨酸和苯丙氨酸；其特点，只见酪氨酸荧光，无苯丙氨酸荧光。,蛋白质分类,B类蛋白质：含色氨酸，只见色氨酸荧光。,C类蛋白质：仅含苯丙氨酸。,1、能量转移,非辐射共振能量转移（激发过程）：将能量转移给与其相互作用的分子，激发分子回到