《微生物检验技术》PPT课件.ppt

微生物检验技术,序论,了解食品中的微生物主要来源于土壤、空气和水，因此应注意食品从原料到加工、贮运、销售等各个环节的卫生。 了解不同微生物对营养的要求有不同，因此，不同食品的变质，引起其变质的微生物类群有不同。 了解评价食品质量的主要标准。 了解食品检验中细菌总数、大肠菌群数的定义及其检验意义。,引言,国内外食品安全形势严峻，恶性事件不断发生。 欧洲“二噁英”、“疯牛病”（20世纪90年代） 日本大肠杆菌O157:H7中毒（1996） 中国SARS（2003） 、东南亚国家禽流感（2004） 美国菠菜大肠杆菌O157:H7污染事件（2006）,食品中的微生物 来自土壤,自然界中微生物的分布极为广泛，水中、高山、海底、荒漠、极地、空气等到处都生存着各种各样、形形色色的微生物。 土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育所必须的一切条件：土壤中含有一定的无机物和有机物；土壤中含有适当的水分；大多数中性偏碱,适合大多数微生物生长；土壤中还含有气体，主要是CO2、O2和N2；温度变化不大（10-25）。 土壤中含有大量的微生物，土壤中的细菌来自天然生活在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体进入土壤的细菌。 土壤中微生物的分布：表层受日光照射和干燥的影响，不利于其生存，所以细菌数量少，离地面10-20厘米土层微生物最多.土层越深，菌数越少。,食品中的微生物 来自水源,水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。水中微生物种类及数量因水源不同而异。 受到污染的水中含有大量的有机物，适合微生物的生存。静水中的微生物多，流水中的少；离岸近处微生物多，离岸远处少；经过大城市的河流，水受到污染，含有大量的粪便.并含有大量的致病菌。 井水和泉水中细菌少，雨水、雪水中也少，城市上空的雨水细菌多，乡村上空雨水细菌少。 国家规定，自来水中，细菌总数每毫升不得超过100个，大肠菌群不得超过3个/升.,食品中的微生物 来自空气,在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空气的传播，特别是在公共场所，人多，空气流通差，细菌多； 大城市上空微生物数量最多，乡村少；森林、草地和田野上空空气清洁，海洋、高山、冰雪覆盖的地面上空，微生物更为稀少。雨后空气特别新鲜。,食品中的微生物 来自人体,人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种控道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等。 皮肤：表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、耻垢杆菌等 口腔： 球菌（甲型或乙型）、乳酸杆菌、螺旋体、梭形杆菌、白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、类白喉杆菌等 胃：正常一般无菌 肠道：类杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、厌氧性链球菌、粪链球菌、葡萄球菌、白色念球菌、乳酸杆菌、变形杆菌、破伤风杆菌、气荚膜杆菌等 鼻咽腔：甲型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、乙型链球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等 眼结膜 ： 皮表葡萄球菌、结膜干燥杆菌、类白喉杆菌等,微生物引起食品腐败变质,食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。食品腐败变质的原因有物理学、化学、生物化学和微生物学方面的原因，但最普遍、最主要的因素是微生物。 环境中无处不存在微生物，食物在生产、加工、运输、储存、销售过程中，很容易被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖，分解食物中的营养素，以满足自身需要。这时食物中的蛋白质就被破坏了，食物会发出臭味和酸味，失去了原有的坚韧性和弹性，颜色也会发生变化从而造成食品变质。,新鲜果蔬和果汁的腐败变质,开始引起新鲜水果变质的微生物是酵母菌和霉菌。引起蔬菜变质的主要是酵母菌、霉菌和少数细菌。起初霉菌在果蔬表皮，或其污染物上生长，然后霉菌侵入果蔬组织，首先分解细胞壁中的纤维素，进一步分解其中的果胶、蛋白质、有机酸、淀粉、糖类等，使其变成简单物质。在外观上出现深色斑点，组织变松、变软、凹陷，渐成液浆状，并出现酸味、芳香味或酒味等。 果汁中主要发生乳酸菌以果汁中糖分、柠檬酸、苹果酸等有机酸为发酵基质的乳酸发酵和最常见的酵母菌引起的酒精发酵。在浓缩果汁中，一般性细菌难以忍受高浓度的糖分。果汁常见的霉菌是青霉，其次是曲霉。果汁变质后会呈现浑浊、产生酒精和有机酸变化，结果原有风味被破坏或产生一些不愉快的异味。,乳及乳制品的腐败变质,乳及乳制品的营养成分比较完全，都含有丰富的蛋白质、极易吸收的钙和完全的维生素等。因此极易为微生物所腐败变质。 鲜乳中污染微生物主要来源于乳房内的污染微生物和环境中的微生物。主要有乳酸细菌、胨化细菌、脂肪分解细菌、酪酸细菌、产气细菌、产碱细菌、以及酵母和霉菌。它们在鲜乳中的生长有一定的顺序性，可以分为抑制期、乳酸链球菌期、乳酸杆菌期、真菌期和胨化细菌期， pH 值也是先下降再逐步回升。 含水量合格的奶粉不适宜微生物生长。但原料奶污染严重，加工又不当的奶粉中可能污染有沙门氏菌（ Salmonella ）和金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）等病原菌。这些病原菌可能产生毒素而易引起中毒。微生物引起淡炼乳变质，一是产生凝乳，即使炼乳凝固成块。由于作用的微生物不同，凝乳又可为甜性凝乳和酸凝乳；二是产气乳，即使炼乳产气，使罐膨胀爆裂；三是由一些分解酪蛋白的芽孢杆菌作用，使炼乳产生苦味。 微生物引起甜炼乳变质也有三种结果：一是由于微生物分解甜炼乳中蔗糖产生大量气体而发生胀罐；二是许多微生物产生的凝乳酶使炼乳变稠；三是霉菌污染时会形成各种颜色的钮扣状干酪样凝块，使甜炼乳呈现金属味和干酪味等。,肉、鱼、蛋类的腐败变质,禽畜肉类的微生物污染，一是在宰杀过程中各个环节上的污染，二是病畜、病禽肉类所带有的各种病原菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、布鲁氏菌（ Brucella ）等。腐生性微生物污染肉类后，在高温高湿条件下很快使肉类腐败变质。肉类腐败变质，先是由于乳酸菌、酵母菌和其他一些革兰氏阴性细菌在肉类表面上的生长，形成菌苔而发粘。然后分解蛋白质产生的 H 2 S 与血红蛋白形成硫化氢血红蛋白而变成暗绿色，也由于各种微生物生长而产生不同色素，霉菌生长形成各种霉斑。同时可产生各种异味，如哈喇味、酸味、泥土味和恶臭味等。 鱼类极易为水生微生物所引起腐败变质。假单胞菌、无色杆菌（ Achromobacter ）、黄杆菌（ Flavobacterium ）、产碱杆菌（ Alcaligenes ）、气单胞菌（ Aeromonas ）等，是新鲜鱼类的主要腐败菌。新鲜鱼类变质后组织疏松，无光泽，由于组织分解产生的吲哚、硫醇、氨、硫化氢、粪臭素等，而常有难闻恶臭。腌鱼由于嗜盐细菌的生长而有橙色出现。 鲜蛋也由于卵巢内污染、产蛋时污染和蛋壳污染而发生微生物性腐败变质。污染鲜蛋的微生物有禽病病原菌、其他腐生性细菌和霉菌等。它们使鲜蛋成为散黄蛋，并进一步分解产生硫化氢、氨、粪臭素等，蛋液成灰绿色，恶臭或粘附于蛋壳、蛋膜上。,罐藏食品的腐败变质,罐藏食品也会发生腐败变质，其原因在于杀菌不彻底，罐内仍残留有一定量的微生物，或者罐头密封不良而漏罐，外界进入微生物。 由于灭菌不彻底而残留的微生物，一般以嗜热性芽孢杆菌为主。它们所引起的罐头腐败变质有三种：一是罐头外观正常，但内部 pH 值可下降 0.10.3 ，称为平酸变质；二是 TA （ thermo-anaerobes ）嗜热性厌氧菌腐败，产气、产酸并可使罐头胀裂；三是产生硫化物腐败食品。如罐头中未杀灭的是厌氧性梭状芽孢杆菌，则可能会进行丁酸发酵，并产生氢气和 CO 2 ，不产芽孢细菌的污染主要是由于罐头漏罐所引的，它们使罐头内食品发生浑浊、沉淀风味改变和产气胀罐。 对于发生腐败变质的罐头食品，必须根据腐败变质的现象作微生物学分析，如是否产气胀罐，是否浑浊沉淀，是否变酸或 pH 上升等等，以便作出正确判断，避免腐败变质的进一步发生。,食品微生物检验的任务和内容,任务 通过测定微生物指标，判断食品在加工环境和食品原料 及其在加工过程中被微生物污染及生长的情况，为食品 环境卫生管理和食品生产管理及某些传染病的防疫措施 提供科学依据。,食品微生物检验的任务和内容,检验的范围 生产环境的检验 原辅料的检验 食品加工、储藏、销售环节的检验 食品检验（重点）,食品微生物检验的任务和内容,食品微生物检验的指标 食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。 菌落总数（个/1g、1cm、1cm2 )：清洁状态的标志；预测食品可能存放的期限. 大肠菌群(MPN/100ml):较为理想的粪便污染的指标菌群；作为肠道致病菌污染食品的指示菌. 致病菌(不得检出）：沙门氏菌、肉毒梭菌、志贺氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌 霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。 其它指标：微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等等。,食品微生物检验技术的发展现状及趋势,我国食品卫生微生物检验质量控制工作现状分析； 食品微生物诊断新技术,食品微生物检验条件,学习目标： 了解微生物检验室的基本要求，通过学习，能独立建设一般的食品微生物检验室。 认识和熟悉微生物检验中常用仪器设备（尤其是普通光学显微镜）及其结构与性能，能正确使用和进行一般的维护。 认识和熟悉微生物检验中常用玻璃器皿，掌握灭菌消毒的技术要求。,微生物检验室,微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。,实验室管理制度,1实验室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。 2进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。 3实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。 4各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行菌种保管制度。 5禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按有关要求执行。 6科、室负责人督促本制度严格执行，根据情况给于奖惩，出现问题立即报告，造成病原扩散等责任事故者，应视情节直至追究法律责任。,实验注意事项,每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验目的、原理和方法。初步熟悉实验操作的主要步骤和环节，对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。 非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应放在不影响实验操作的地方 每次实验前须用湿布擦净台面，必要时可用0.1“新洁尔灭”溶液擦。实验前要洗手，以减少染菌的概率。 微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌污染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点： 操作时要预防空气对流：在进行微生物实验操作时，要关闭门窗，以防空气对流。 接种时不要走动和讲话：接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。 含菌器具要消毒后清洗：凡用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5%石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染环境。 含培养物的器皿要杀菌后清洗：在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前，应先煮沸10min或进行加压蒸汽灭菌。 要穿干净的白色工作服：微生物学工作者在进行实验操作时应穿上白色工作服，离开时脱去，并经常洗涤以保持清洁。 凡须进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者姓名（或组别），放在指定的温箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果，按时交实验报告。 实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舔标签、笔尖或手指等物，以免感染。 节约药品、器材和水、电、煤气。 各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置妥当。 实验完毕，立即关闭煤气，整理和擦净台面，离开实验室之前要用肥皂洗手。值日生负责打扫实验室及进行安全检查(门窗、水、电及煤气等),实验注意事项,冷静处理意外事故： 打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液洒到桌面或地上时，应立即以5%石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液覆盖，30min后擦净。若遇皮肤破伤，可先去除玻璃碎片，再用蒸馏水洗净后，涂上碘酒或红贡。 菌液污染手部皮肤：先用70%乙醇棉花拭净，再用肥皂水洗净。如污染了致病菌，应将手浸于23来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液中，经1020min后洗净。 菌液吸入口中：应立即吐出，并用大量自来水漱口多次，再根据该菌的致病程度作进一步处理： 非致病菌：用0.1高锰酸钾溶液漱口。 一般致病菌（葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌等）：用3H2O2、0.1高锰酸钾溶液或0.02米他芬液漱口。 致病菌：如吸入白喉棒杆菌，在用法处理后，在注射1000U白喉抗毒素作紧急预防；若吸入伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌或霍乱弧菌等肠道致病菌，在经法处理后，可注射抗生素预防发病。 衣服或易燃品着火：应先断绝火源或电源，搬走易燃物品(乙醚、汽油等)，再用湿布掩盖灭火，或将身体靠墙或着地滚动灭火，必要时可用灭火器。 皮肤烫伤：可用5鞣酸、2苦味酸（苦味酸氨苯甲酸丁酯油膏）或2龙胆紫液涂抹伤口。 化学药品灼伤 强酸、溴、氯、磷等酸性药剂：先用大量清水洗涤，再用5NaHCO3或5%NaOH中和。 NaOH、金属钠（钾）、强碱性药剂：先用大量清水洗涤，再用5硼酸或5乙酸中和 石炭酸：用95乙醇洗涤 如遇眼睛灼伤：则应先用大量清水冲洗，再根据化学品的性质作分别处理，例如，遇碱灼烧可用5硼酸洗涤，遇酸灼烧可用5NaHCO3洗涤，在此基础上再滴入12滴橄榄油或液体石蜡加以润湿即可。,检验室建设要求,选址与规模 （1）化验室应建设在远离粉尘、噪声、散发异味气体等地点，电源电压应当相对稳定的地点。根据企业规模和产品种类，应建设不同要求的化验室。但是，最小建筑面积：理化检验室不能小于30平方米；微生物检验室（无菌室）不能小于8平方米。这样有助于仪器设备的合理摆放，便于操作，便于样品流通和空气流通。 （2）室内应有足够的照明条件。 （3）室内必须配置干粉或二氧化碳灭火器，以备电器或化学品燃烧灭火使用。 （4）所有电器插坐均应有牢固的地线装置，以防止设备带电，造成操作人员触电事故。有条件的还应在地面铺设绝缘胶板。其次还应必须有上下水设施、通风橱（在通风橱内进行对发生出有害气体的分析操作）。 室内的布局 (1)动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器等）。 (2)常温与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其它一切设备分开，不然会影响其它设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其它设备，影响其使用寿命。 (3)化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析台的摆放应远离热源设备。 化验室应建立可行的规章制度：化验室人员工作管理制度、标准管理制度、危险化学试剂的管理制度 、检验过程的管理制度 检测设备检定管理制度,检验室建设布局图,微生物实验室主要设备和器具,无菌室（接种室）或接种箱 恒温箱 电烘箱（干燥箱） 冰箱 高压蒸汽灭菌锅 离心机 接种针 天平 酒精灯 显微镜 常用玻璃器皿 均质器、试管夹，吸管，移液枪，脱脂棉，牛皮纸，棉绳，纱布，剪刀,无菌室建设,新建无菌室的处理程序,先用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面，再用甲醛加高锰酸钾熏蒸空气。日后要定期熏蒸； 每两星期用酒精棉球擦拭紫外线灯管； 每次使用无菌室前用紫外灯照射3060分钟； 每次使用完无菌室后，要及时用3%的煤酚皂擦洗工作台面及地面。,超净工作台的使用,使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。 接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机 工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰 操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。 最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。 每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。 每月进行一次维护检查，并填写维护记录 。 每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。 取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘、用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦干；要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,否则会影响杀菌能力；设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。,微生物检测作业规范,各培养液配制完成后，杀菌前放入冰箱冷藏保存，但必须在48小时内对其进行分装杀菌使用。 已杀菌未开封的培养液在24小时内可直接使用；已杀菌未开封超过24小时或者已杀菌但开封而未用完的培养液都必须重新杀菌后使用。同一培养液反复杀菌不超过2次。杀菌时间由当班微检员用油笔直接写在瓶体。 杀菌锅密闭前，内桶顶部覆盖一层报纸。 进入无菌间作业时必须做到： 缓冲间、无菌间的紫外灯开启时间超过半小时； 关闭紫外灯后，微检员把作业过程中将用到的所有物品放在缓冲间，同时在缓冲间更换专用的工作衣，同时佩戴口罩和卫生帽，然后再将物品转移到无菌间； 作业时关闭紫外灯、空调、和无菌操作台风机；每次最多做4个样品。每次均做空白对比（除非有特殊说明）。 完成作业后，立即做好相关标识、填写微生物检验培养登记表，然后清理无菌间。清理结束后，开启紫外灯杀菌30分钟。 无菌间只允许放置无菌操作台、转椅、水浴锅；无菌操作台上最多只允许摆放以下物品：,微生物检测作业规范,微生物培养24小时后，当班微检员仔细观察、如实填写培养的现象，任何异常情况都必须及时报告；晚班的微检员可将有异常情况的培养液交接给白班，并保证其免受污染。 口罩、卫生帽每人次使用两天，无菌间缝单日定期拖地、专用的工作衣每周定期清洗，具体人员由班长另行安排。,细菌形态学检验技术,细菌形态学检验内容：菌体形态、大小、排列、特殊结构 细菌形态学检查方法：不染色细菌标本检查法和染色细菌标本检查法,不染色细菌标本检查法,不染色的细菌标本的镜检可直接观察到细菌活体的形态、大小、运动（了解菌是否有鞭毛） 悬滴法和压滴法,不染色细菌标本检查法 悬滴法,制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌于盛有12ml无菌水的试管中，制成轻度浑浊的菌悬液。 涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。 滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用削尖的记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。 盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘合在一起，然后翻转凹玻片，菌液正好悬在凹槽的中央，再用火柴棒轻压盖玻片使四周边缘闭合，以防菌液干燥。 镜检：先用低倍镜找到标记，再稍移凹玻片即可找到菌悬滴的边缘，然后将菌液移到视野中央。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）,不染色细菌标本检查法 压滴法（水封片法）,制水封片：加1滴菌液于洁净无油的载玻片中央，然后取1滴洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，再慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。若镜检好氧菌时，应在水封片中留12个小气泡，然后再观察气泡四周细菌的运动能力，否则因盖玻片内供氧不足而抑制了细菌的运动。 镜检：先用低倍镜观察，然后再转至高倍镜或油镜下观察，观察的要求同悬滴法。,不染色细菌标本检查法 注意事项,结果记录 注意事项 检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动 制水封片时，菌液不可加得太多，因过多的菌液会盖玻片下流动，从而影响了对细菌正常运动的观察。,染色细菌标本检查法 染料,细菌染色用的染料 酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红） 碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细菌一般带负电，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。 复合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。 单纯染料：不能与被染物生成盐类 影响染色的因素 细菌的结构：细胞壁的结构、细胞膜的通透性、膜孔的大小 培养基：组成、菌龄、pH,染色细菌标本检查法 制片方法,制片：（制片是染色的关键，如不注意菌体涂布的均匀度，会造成染料的大面积堆积，而使观察结果不理想） 制片：在干净的载波片（平时放在95%酒精中)上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接种工具进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合做成悬液，并涂成直径约1cm的薄层。若材料为液体培养物或自固体培养物中洗下制备的菌液，则可直接涂布于载玻片上。涂布要均匀，菌体间少重叠。 干燥：涂布最好在室温下使其干燥，有时为之使之干燥得快些，小心地在酒精灯火焰高处微微加热。 固定：标本干燥后即进行固定，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快地来回通过34次，共23s，并不时以载玻片的加热面触及皮肤，其目的：杀死微生物，固定细胞结构；保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，防止标本被水洗掉；改变染料对细胞的通透性，因为死细胞的原生质比活细胞的原生质易于染色。 注意事项： 载玻片要洁净无油，否则菌液涂不开，且固定效果不好，水洗时易被水冲掉。 为避免因菌数过多聚成团而不利于观察个体形态，可在载玻片一端加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于水滴中进行稀释，涂布成薄层。 干燥时，切勿靠火焰太近或加热时间过长，以防标本烤枯而使菌体变形。,染色细菌标本检查法 染色分类,单染色法：用一种染色剂对涂片进行染色。该法简便易行，但仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构，适用于微生物的形态观察。 复染色法：主要的复杂染色法有革兰氏法和抗酸性及特殊染色法。因为细菌除了具有细胞壁、细胞膜、原生质和核等基本构造外,某些细菌还具有荚膜、芽孢、鞭毛和异染颗粒等特殊结构，这些结构不能被一般染色方法着色，必须用特殊的方法才能着色。 负染色法：负染色法是一种特殊的染色方法，是指背景着色而细菌本身不着色。一般使用酸性染料，如刚果红或水溶性苯胺黑。固定染色涂片可浸于酸性酒精中，因刚果红经酸性酒精处理后，涂片的背景便从红色（盐类的颜色）转变为蓝色（即刚果红游离的颜色），这样可使对比性更为鲜明。 负染色法除用于观察细胞形态外，还可区别死菌与活菌，因死菌可被酸性染料着色，部分自溶的细菌也能轻度染上酸性染料，而活菌却不着色。,染色细菌标本检查法 简单染色方法,染色细菌标本检查法 革兰氏染色法,阳性菌,阴性菌,染色细菌标本检查法 革兰氏染色法,注意事项： 单一菌落染色后看到红色杆菌和紫色杆菌共存的情况，特别明显既有红色的，也有紫色的？（脱色时间：受涂片之厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。菌龄：选用培养1824h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应） 显微镜观察：紫和红好象都是，焦距调的稍近时紫色，调的稍远时红色，两种情况下形状都看的挺清楚，杆状。关于颜色你们怎么确定的？ （对照：当确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合图片） 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 用洗衣粉水煮沸、清洗、沥干备用。 结果记录：,染色细菌标本检查法 芽孢染色法,原理： 细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但 是一旦着色又难以脱色。芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下进行。染色 完毕，用自来水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水洗 掉，而进入芽孢中的孔雀绿却难以溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染 使菌体和芽孢呈现不同的颜色。 方法与步骤 制片：将培养24小时的细菌涂片、干燥、固定 染色：将孔雀绿染色液滴加35滴于标本上。用试管夹夹住载玻片在火焰上加热约5min（当染料冒蒸汽时开始计时）。在加热过程中要随时加染色液，切勿煮沸或使样本干涸。 水洗：待载玻片冷却后，用自来水冲洗 复染：用番茄红染色液染色1min。 水洗、干燥，置于油镜下观察并绘图说明。 结果,染色细菌标本检查法 芽孢染色法,改良方法： 制备菌液：加12滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。 加染色液：加5孔雀绿染色液23滴于小试管中，用接种环搅拌使染色液与菌液充分混合。 加热：将此试管浸于沸水浴中，加热1520min。 涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，并涂成薄膜。 固定：将玻片通过微火3次。 脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。 复染：加沙黄染色液，染23min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水吸干。 镜检：用油镜观察 结果纪录,染色细菌标本检查法 芽孢染色法,注意事项： 供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体内。 巨大芽孢杆菌在37条件下培养1214h效果最佳。 改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规法优越，可优先使用。 用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次从小试管中挑取被染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。,染色细菌标本检查法 鞭毛染色法,鞭毛染色方法基本原理雷同，即在染料前先经媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使 鞭毛直径加粗，然后再进行染色。 银染色法： 清洗玻片：将玻片插在专用金属架上，再放入洗衣粉过滤液（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒）中，煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗，晾干。再放浓洗液中浸泡56d。使用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95乙醇中脱水。过火去乙醇，立即使用。 配制染色液：A液：鞣酸（丹宁酸）5g，FeCl3 1.5g，蒸馏水100ml。待溶解后，加1NaOH溶液1ml和15甲醛溶液2ml；B液：硝酸银2g溶于蒸馏水100ml中。 在90mlB液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mlB液小心滴加至澄清液中，至出现轻雾状为止（此操作非常关键，应格外小心）。在整个滴加过程中要边滴边加充分摇荡。配好的染色液当日有效，4h内效果最好。 涂片：用接种环挑取数环菌液于玻片的一端，立即将玻片倾斜，让菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片在空气中自然干燥。 染色：滴加A液（46min) 用蒸馏水充分洗净A液 用B液冲去残水，在用B液于涂片上，用微火加热至冒烟，维持0.51min（加热时应随时补充蒸发掉的染色，不可使玻片出现干涸区 用蒸馏水洗，自然干燥。 镜检：用油镜观察，并记录结果。,染色细菌标本检查法 鞭毛染色法,Leifson氏染色法： 清洗玻片：同银染法 配制染色液：A液：碱性复红1.2g，95乙醇100ml；B液：鞣酸3g，蒸馏水100ml（如加0.2苯酚，可长期保存）；c液：NaCl 1.5g，蒸馏水100ml。 染色液分别贮藏于磨口玻璃瓶中，在室温下较稳定。使用前将上述溶液等体积混合，将混合液贮藏于封密性良好的瓶中，置冰箱中可保存数星期。在较高温度下因混合液发生化学变化而使着色力日益减弱。 菌液的制备及涂片：菌液的制备同银染法用记号笔在玻片的反面划分34个相等的区域放1环菌液于每个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一边，并用滤纸吸去多余的菌液在空气中自然干燥。 染色：加染色液于第一区，使染料覆盖涂片区。数隔分钟后染料加入第二区，以后以此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，且节约材料。在染色过程中要仔细观察，当整个玻片出现铁锈色沉淀和染料表面出现金色膜时，即用水轻轻地冲洗，一般约染10min。 在没有倾去染料的情况下，就用自来水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀自然干燥。 镜检,染色细菌标本检查法 鞭毛染色法,注意事项： 银染色法比较容易掌握，但染色液必须每次配制，比较麻烦。 Leifson氏染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。其优点是染色液可保存较长时间。 细菌鞭毛极细，很容易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心。菌龄较老的细菌鞭毛易脱落，所以在染色前应将变形杆菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接几代，以增强细菌的活动力。最后一代菌种放37恒温箱中培养1518h。然后用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有12ml无菌水的试管中，使菌液呈轻度浑浊。将该试管放37恒温中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。,染色细菌标本检查法 荚膜染色法,荚膜是细菌在新陈代谢过程中形成的分泌于细胞壁外的黏液状物质。其主 要化学成分是多糖、多糖类物质。荚膜的折光率低，与染料的亲和力差， 不易着色。通常采用负染色方法：使菌体和背景着色而荚膜在菌体周围呈 一透明圈。由于荚膜的含水量在90以上，故染色时一般不用热固定或微 热固定，以免荚膜皱缩变形。,染色细菌标本检查法 荚膜染色法,制片：在载玻片一端加一滴6葡萄糖液，取少许培养72h的被检样菌与其充分混合，再滴一滴新配制的黑色素溶液（或墨汁），混匀。左手持载玻片，右手拿另一光滑的载玻片（推片），将推片一端边缘置于菌液前方，然后稍后后拉，当接触菌液后，轻轻地左右移动，使菌液沿推片接触后缘散开，以30。 角迅速而均匀地将菌液推向玻片另一端，将菌液涂成一薄膜，风干。 染色：加番茄红染色液于标本上，30s后，用细水流适当冲洗。 干燥、镜检：背景成黑色，菌体呈红色，荚膜无色 结果与讨论 按上述方法，在番茄红之前，用甲醇固定1min亦可； 按上述方法，用石炭酸复红液代替蕃红液，染色2min，结果同上。 Tyler法：主要采用结晶紫冰醋酸染色液染色57min。然后用20CuSO4 水溶液洗涤，干燥后镜检。结果荚膜呈蓝紫色，细胞暗蓝色。,培养基制备技术 -玻璃器皿的清洗,在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。 1、新购的玻璃器皿 除去包装沾染的污垢后，先用热肥皂水刷洗，流水冲净，再浸泡于的工业盐酸中数小时，使游离的碱性物质除去，再以流水冲净。对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上将水空干，即可使用。 2、用过的玻璃器皿 凡确无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用后可随时冲洗，吸取过化学试剂的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必须经过适当消毒后，将污垢除去，用皂液洗刷，再用流水冲洗干净。若用皂液未能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。洗液的主要成份是重铬酸钾和浓流酸，其作用是将有机物氧化成可溶性物质，以便冲洗。洗液有很强的腐蚀作用，使用时应特别小心，避免溅到衣服、身体和其他物品上。,培养基制备技术 -培养基分类,根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分： ）天然培养基 天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 ）合成培养基 合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。 ）半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。 根据培养基的物理状态来区分： ）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。 ）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。 ）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,培养基制备技术 培养基的分类,根据培养基的用途来区分： (1)通用培养基：培养异氧细菌最常用的培养基是牛肉膏蛋白胨培养基；配制适合于厌氧菌生长的培养基时，通常须在培养基中加入适量的还原剂如巯基醋酸钠、维生素C或半胱氨酸来降低培养基的氧化还原电位，以利于厌氧菌的生长。 (2)鉴别培养基：是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌落的培养基。(伊红美蓝琼脂、乳糖胆盐发酵培养基、亚硫酸铋琼脂、微生物快速显色培养基） (3)选择性培养基：根据某微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌。（马丁氏培养基、Ashby无氮培养基） 有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。,培养基制备技术 培养基制备的基本方法和注意事项,培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长; 因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。 培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内:液体分装至试管1/4左右 为宜；如固体则分装量为管高的1/5；半固体培养基，则分装至试管的1/21/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应不超过容积的一半为宜；9cm的培养皿可倒入15ml培养基。 一般培养基可采用121C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50C左右的培养基中。,灭菌和消毒,消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法， 灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。,灭菌和消毒 物理方法,温度 ：利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。 a.灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。 b.干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160C，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。 附：电热恒温干燥箱（俗称“烤箱”）的使用 把待灭菌的物品均匀地放入烤箱中，关上箱门，调节温度至160C，打开电源，待温度上升至160C时计时，维持该温度0.5-1小时。注意：多观察几次温度，防止温度失控。用量较少的实验室可以做几个铁皮筒，盖子侧面带孔，灭菌时将孔打开，灭菌冷却过后将孔关闭。可以将吸管每支单独用白纸包裹用脱水粘上（防止纸散开来），装入铁皮筒灭菌，使用时可以单独拿，避免污染其它吸管。玻璃皿也可以单独用白纸包裹用脱水粘上，装入铁皮筒灭菌。无菌瓶可以盖上盖子，用用白纸包起盖子，用棉线扎起来，不可以用尼龙线，因为尼龙线不耐高温，易断。,灭菌和消毒 物理方法,湿热灭菌法:在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。 a.巴氏消毒法：有些食物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法一般在62C，30分钟既可达到消毒目的。此法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏消毒法。 b.煮沸消毒法：直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，则效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。 c.间歇灭菌法：上述两种方法在常压下，只能起到消毒作用，而很难做到完全无菌。若采用间歇灭菌的方法，就能杀灭物品中所有的微生物。具体做法是：将待灭菌的物品加热至100C，1530分钟，杀死其中的营养体。然后冷却，放入37C恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体。第2天再重复上述步骤，三次左右，就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。,灭菌和消毒 物理方法,d. 加压蒸汽灭菌法：把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121C。在这种情况下，微生物（包括芽孢）在1520分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。如灭菌的对象是砂土、石蜡油等面积大、含菌多、传热差的物品，则应适当延长灭菌时间。 在加压蒸汽灭菌中，要引起注意的一个问题是，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。 附：高压锅的使用 打开锅盖，取出内锅，观察水量，补充水量至比墩子略高，将需灭菌的物品放入内锅，盖 上盖子，对称旋紧螺栓，关闭放气阀，打开电源，待压力表上指针指向0.05时打开放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，待压力表上指针指向0.05时再次打开 放气阀放冷气，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀；冷气放完后，待压力表上指针指向 0.10时打开放气阀，等到压力表上指针指向0时关闭放气阀，反复放气2-3次，最后拨下电 源，不打开放气阀，让其自然冷却。取物品时一定要将放气阀打开，等到压力表上指针指 向0时方可对称旋松螺栓，打开盖子取出物品。,灭菌和消毒 物理方法,影响灭菌的因素 a.不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒在5065C，10分钟就会被杀死；但各种孢子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在121C，12分钟才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄菌对热更敏感; b.微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数量越多，热死时间越长; c.培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，pH在7附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热能力下降，而不同的盐类可能对灭菌产生不同的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间长。 灭菌对培养基成分的影响 a.pH值普遍下降; b.产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀; c.不少培养基颜色加深; d.体积和浓度有所变化; e.营养成分有时受到破坏。,灭菌和消毒 物理方法,辐射：利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所以应用越来越广，目前主要应用在以下几个方面： ）接种室、手术室、食品、药物包装室常应用紫外线杀菌。 ）应用射线作食品表面杀菌，射线用于食品内部杀菌。经辐射后的食品，因大量微生物被杀灭，再用冷冻保藏，可使保存期延长。 过滤：采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从而达到除菌的目的。这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体培养基的灭菌以及气体的灭菌。它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有时会给实验带来一定的麻烦。,灭菌和消毒 化学方法,一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能