《生物制药》PPT课件.ppt

第四章 酶 工 程 制 药,国际酶工程学会（1971年）定义： 酶工程是研究和开发酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等的工程科学。,酶工程制药主要包括药用酶的生产和酶法制药两方面的技术。,药用酶是指可用于预防和治疗疾病的酶。,酶法制药是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程.,药用酶：,酶法制药：,第一节 概述,酶是生物催化剂。是由活细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂，它能催化各种生物化学反应。,一、酶的催化特性,催化剂的共同点 量少高效； 只加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。 都是通过降低反应分子的活化能来加快化学反应的速度。 酶的特性 高效催化 高度专一 条件温和,1、酶的专一性强,酶的专一性（specificity)：是指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反应。,绝对专一性(absolute specificity)：只能作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物 。 立体结构特异性(stereo specificity)：作用于立体异构体中的一种。 相对专一性(relative specificity)：作用于一类化合物或一种化学键。,根据酶对其底物结构选择的严格程度不同，酶的专一性可大致分为以下2种类型：,酶的催化效率通常比非催化反应高 1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。 酶和一般催化剂加速反应的机理都是降低反应的活化能(activation energy)。酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。,3、酶的作用条件温和,酶的催化不需要较高的反应温度。 酶的催化作用一般都在常温、常压、pH近乎中性的温和条件下进行，不需高温高压和极端pH条件。,二、影响酶催化作用的主要因素,1、酶浓度对酶促反应的影响,在有足够底物和其他条件不变的情况下： v = k E,酶促反应的速度与酶浓度成正比,2、底物浓度对酶促反应的影响,一级反应 v = k S,零级反应 v = k E,混合级反应,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,3、pH对酶促反应的影响,1.最适pH,2.有效pH,表现出酶最大活力的pH值,在一定的pH范围内酶是稳定的,pH对酶作用的影响机制： 1.环境过酸、过碱使酶变性失活； 2.影响酶活性基团的解离； 3.影响底物的解离。,双重影响 温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。,4、温度对酶促反应的影响,最适温度 (optimum temperature)： 酶促反应速度最快时的环境温度。其不是酶的特征性常数,5、激活剂对酶促反应的影响,激活剂 使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。其中大部分是一些无机离子和小分子简单有机物。如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等； 无机离子对酶的激活作用： （1）与酶分子肽链上的侧链基团相结合，稳定酶催化作用所需的构象。 （2）作为底物与酶蛋白之间联系的桥梁。 （3）可能作为辅酶或辅基的一个组成部分，协助酶的催化作用。,使用激活剂注意,激活剂对酶的作用具有一定的选择性，使用不当，会适得其反，激活剂之间有时存在拮抗现象。 激活剂的浓度有一定的范围，超出此范围，会得到相反的效果。,6、抑制剂对酶促反应的影响,使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂（I）。,（1）. 不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。,+ I EI,ESH +ICH2COOH ESCH2COOH + HI,抑制作用特点：不可逆性抑制，抑制剂浓度越高，抑制作用时间越长，抑制作用越强。,（2）可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。,抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。,E,v,1,2,3,1. 反应体系中不加I。,2.反应体系中加入一定量的不可逆抑制剂。,3.反应体系中加入一定量的可逆抑制剂。,I ,I ,竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。,特点： 1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位。 2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的 亲和力大小。 3）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。,+ I EI,非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。,特点： 1）随着抑制剂浓度I的增加，抑制作用增强。 2）底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。 3）抑制剂不改变酶对底物的亲和力。,反竞争性抑制作用：I与酶和底物的中间复合物结合而不与游离酶结合，从而抑制酶活性。,特点： 1）随着抑制剂浓度I的增加，抑制作用增强。 2）底物浓度的增减对抑制作用不产生影响。 3）抑制不改变酶对底物的亲和力。,三、酶的分类与命名,（一）、酶的命名,1、习惯名：命名原则如下 （ 1.）根据酶的底物命名。 （2.）根据所催化的反应的性质命名。 （3.）有的酶结合上述两个原则命名。 （4.）在这些基础上有时还加上酶的来源或酶的其它特点。,2、系统名：要求能确切表明底物的化学本质及酶的性质，包括两部分，即底物名称及反应类型，底物间用“：”分开，若底物之一是水则可略去不写。,ATP+CH3COOH ADP+CH3C,O,P,其系统名为：ATP：乙酸磷酸转移酶,（二）、酶的分类,根据反应性质分为六大类 1、氧化还原酶类：催化氧化还原反应，涉及H 和电子的转移。如脱氢酶类。 2、转移酶类：催化分子间功能基团的转移。如转氨酶类。,3水解酶类：催化水解反应。如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、蔗糖酶等。 4裂合酶类：催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。如醛缩酶脱氨酶 脱羧酶,5异构酶类：催化同分异构体的相互转变。 6、合成酶：与ATP 分解相偶联，并由二种物质合成一种物质。如天冬酰胺合成酶 丙酮酸羧化酶,在每一大类酶中，又根据底物中被作用的基团或键的特点分为若干亚类，然后再把属于某一亚类、亚亚类的酶按顺序排好，这样把已知的酶分门别类地排成一个表，叫做酶表。 类 亚类 亚亚类 序号,如 EC1.1.1.27 为乳酸：NAD+氧化还原酶 EC1.1.1.37 为苹果酸：NAD +氧化还原酶 EC1.1.1.1 为乙醇：NAD +氧化还原酶,一些酶的命名举例,四、酶活力及其测定,酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。,所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。,1. 酶活力及测定,酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。,酶活力测定,酶活力测定包括两个阶段。首先要在一定条件下，将酶与其作用底物混合均匀，反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。,步骤：,（1）根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配置成一定浓度的底物溶液。,（2）根据资料或试验结果，确定酶催化反应的温度、pH值等条件。,（3）在一定的条件下，将一定量的酶液与一定量的底物溶液混合均匀，记录开始的时间。,（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用各种适合的生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。, 反应时间一到，立即取出一定量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活。 立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活。 立即加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶促反应的最适pH值，从而终止反应。 将取出的反应液立即置于冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低到10以下。,常用的终止酶反应的方法：,2. 酶活力单位,酶活力单位(1961年)：在特定条件下，每分钟催化1微摩尔底物转化为产物的酶量，定义为一个酶活力单位，用U表示。 特定条件是指：温度可采用25或其他选用的温度，其它条件均采用最适条件。,3. 酶的比活力,指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数,比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大，表示酶越纯。,第二节 药 用 酶 的 生 产,一、药用酶的种类,1、 蛋白酶:,蛋白酶目前可用作：,(1)消化剂,(2)消炎剂,(3)治疗高血压, -淀粉酶水解淀粉生成糊精，是国际上广泛使用的消化药。最早采用米曲霉生产的复合 -淀粉酶，其中还含有蛋白酶、脂肪酶等多种酶。但由于米曲霉 -淀粉酶的适宜pH值为4.56.0所以在胃中易受胃酸破坏。用黑曲霉酸性淀粉酶作为消化药，不易受胃酸破坏，效果会更好。,2 、-淀粉酶,脂肪酶催化脂肪水解生成甘油和脂肪酸，可 作为消化剂使用。 假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂白和乳糜微粒，可用于预防和治疗高血脂病。,3、 脂肪酶,该酶水解右旋糖酐生成小分子产物，对龋齿有 显著的预防效果 。 龋齿是一种常见的口腔疾病，其病因是由于口腔中的细菌将蔗糖合成结构类似右旋糖酐的粘性多糖，粘附在牙齿表面，引起细菌滋生，而使牙齿受到损坏。将右旋糖酐酶应用到牙膏，可有效防治龋齿的产生。,4 、右旋糖酐酶,溶菌酶具有抗菌，消炎，镇痛等疗效， 是一种广泛应用的药用酶 。 溶菌酶作用于细菌的细胞壁，使其受到 破坏，而使病原菌、腐败性细菌等溶解死亡。 溶菌酶与抗生素联合使用，可显著提高 抗生素的疗效.,5、 溶菌酶,SOD催化超氧负离子（O-2）进行氧化还 原反应生成氧和双氧水。（2 O-2+2H+H2O2+O2） 由于SOD能清除体内的超氧负离子，具有抗氧化、抗辐射、抗衰老的功效，保护机体内的DNA、蛋白质和细胞膜等免遭超氧负离子的破坏，对红斑狼疮、皮肤炎、结肠炎、白内障、风湿性关节炎、氧中毒等疾病有显著疗效，对辐射有防护作用。,6、 超氧化物歧化酶(SOD),Asn Asp+NH3 抗癌药物 癌细胞不含天冬酰胺合成酶,本身不能 合成L-天冬酰胺，而外源的L-Asn又被加入 的L-天冬酰胺酶分解掉，因此，蛋白质的合 成受阻，从而导致癌细胞死亡。,7、L-天冬酰胺酶,链激酶：-溶血性链球菌产生的一种蛋白酶，可 催纤维蛋白酶原，激活成纤维蛋白酶而 将纤维蛋白水解使血栓溶解。 尿激酶：从尿液中分离得到的一种蛋白酶，具有溶 解血栓的疗效，其副作用比链激酶小。 纳豆激酶：由纳豆杆菌或枯草芽孢杆菌产生的一种 蛋白酶，具有溶解血栓的功效，可以口服。,8、溶栓酶,9、乳糖酶,乳糖酶又称-半乳糖苷酶，它催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖。 乳糖酶可用于治疗乳糖酶缺乏症。,运用各种生化分离技术，从动物、植物及微生物等的含酶细胞、组织或器官中提取、分离和纯化各种药用酶的方法称为提取法。,二、 药用酶的生产方法,1、 提取法：,利用各种动物、植物和微生物细胞的生命活动而获得人们所需的酶的方法称为生物合成法。 主要是利用微生物细胞进行生产。,2 、生物合成法：,化学合成法是60年代中期出现的新技术。 1965年，我国人工合成胰岛素的成功，开辟 了蛋白质化学合成的新纪元。,3 、化学合成法:,1969年，美国首次用化学合成法得到 含有124个氨基酸的核糖核酸酶。,化学合成法合成的成本高昂，且只能合成已知化学结构的酶, 至今停留在实验室阶段。,通过筛选、诱变或采用基因工程、 细胞工程等技术而获得。,三 、药用酶生产细胞的选择,用于酶发酵生产的细胞必须具备的条件：,1、 酶的产量高,2、 容易培养和管理 适应性较强，易于生长繁殖，便于管理。 3、 产酶稳定性好 不易退化，能稳定地用于生产。 4 利于酶的分离纯化 胞外酶,5 、安全可靠,常用的产酶微生物有：,枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,大肠杆菌（Escherichia coli）,黑曲霉（Aspergillus niger）,米曲霉（Aspergillus orizae）,木霉（Trichoderma）,青霉（penicillium）,根霉（Rhizopus）,毛霉（Mucor）,链霉菌（Streptomyces）,啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,假丝酵母（Candida）,对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高 。,四、 提高药用酶产量的措施,1 、添加诱导物：,不同的酶有各自不同的诱导物。然而有时一种诱导物可诱导生成同一酶系的若干种酶，如-半乳糖苷可同时诱导-半乳糖苷酶、透过酶和-半乳糖乙酰化酶3种酶(协同诱导)。 同一种酶往往有多种诱导物，实际应用时可根据酶的特性、诱导效果和诱导物的来源等方面进行选择。,（1）酶作用的底物：乳糖诱导-半乳糖苷酶 青霉素诱导青霉素酶 （2）酶的反应产物：半乳糖醛酸诱导果胶酶 纤维二糖诱导纤维素酶 没食子酸诱导单宁酶,诱导物的种类：,酶的最有效的诱导物。 如：IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）对-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍；蔗糖甘油单棕榈酸酯对蔗糖酶的诱导效果比蔗糖高几十倍等。,（3）酶的底物类似物:,分解代谢物阻遏 阻遏作用 产物反馈阻遏 末端产物 阻遏物 酶催化反应产物 分解代谢物 控制阻遏浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。,2 、控制阻遏物浓度,末端产物阻遏：可通过控制末端产物的浓度使阻遏解除。,酶催化反应产物阻遏：可通过控制酶催化反应产物的浓度使阻遏解除。,解除：,分解代谢物阻遏，可通过下列方法解除： 控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度补料分次流加碳源 添加一定量的CAMP。,阳离子型 离子型 阴离子型 表面活性剂 两性离子型 非离子型,3、 添加表面活性剂,由于离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，不能用于酶的发酵生产。,非离子型表面活性剂，如Tween、Triton等，可积聚在细胞膜上，增加细胞的通透性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的产量。 此外，添加表面活性剂有利于提高某些酶的稳定性和催化能力。,产酶促进剂：是指可以促进产酶，但作用机理 并未阐明清楚的物质。 添加产酶促进剂往往对提高酶产量有显著效果。,4、 添加产酶促进剂,五、 药用酶的分子修饰,1、 酶分子修饰：,通过各种方法使酶分子结构发生 某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程称为酶分子修饰。,提高酶活力，增加酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性。,2、 酶分子修饰的目的：,通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰，简称为离子置换法。,3、酶分子修饰技术(方法),(1)金属离子置换修饰：,金属离子置换修饰法只适用于本来在结构中含有金属离子的酶。,用于酶修饰的金属离子，往往是二价金属离子，如：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。,酶液+EDTA等金属螯合剂EDTA-金属螯剂用透析、超滤、分子筛等方法除去失活酶液+其他金属离子酶活力升高，稳定性增强。,金属离子置换修饰过程：,例：,锌型蛋白酶钙型蛋白酶，酶活力提高2030%； -淀粉酶的镁型、锌型钙型，稳定性增强，酶活力提高3倍以上。,利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法。,(2)大分子结合修饰:,右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等，这些大分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分子以共价键结合，对酶分子进行修饰。,大分子修饰剂：,大分子结合修饰的作用：,水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后， 可使酶的空间结构发生某些改变，使酶的活性 中心更有利于和底物结合，并形成准确的催化 部位，从而使酶活力得以提高。 . 例：每分子胰蛋白酶用11分子的右旋糖酐修饰后， 酶活力可提高30%等。,、通过修饰提高酶活力：,酶的稳定性用半衰期来表示。 酶的半衰期：是指酶的活力降低到原来一半时所 经过的时间。,、通过修饰增加酶的稳定性：,用可溶性大分子与酶结合进行酶分子修饰，可在酶的外围形成保护层，使酶的空间构象免受其他因素的影响，从而增加酶的稳定性，延长其半衰期。,、通过修饰降低或消除抗原性,抗体与抗原之间的特异结合是由于它们之间特定的分子结构所引起的。采用酶分子修饰方法使酶的结构产生某些改变，就有可能降低甚至消除其抗原性。 例：聚乙二醇结合修饰后的L-天冬酰胺酶， 其抗原性可完全消除。,要想获得理想的修饰效果，必须确定最佳修饰剂的种类和浓度、温度、pH值和反应时间。,（3）肽链有限水解修饰,酶蛋白的肽链被水解后，可能会出现以下3种情况中的一种：,酶活性中心被破坏，失去催化功能； 肽链的一部分水解后，仍可维持活性中心的完整构象，则酶的活力仍可保持或损失不多； 肽链的一部分水解除去以后，有利于活性中心与底物的结合，酶活力提高。,在后两种情况下，肽链的水解在限定的肽键上进行，称为肽链有限水解 。,利用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。,肽链有限水解修饰：,有些酶原来不显示酶活力或酶活不高，利用某些具有高度专一性的蛋白酶对它进行肽链有限水解修饰，除去一部分肽段或若干个氨基酸残基，就可使其空间构象发生改变，有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，从而显示出酶的催化活性或提高其酶活力。,肽链有限水解修饰作用：,、显示或提高酶活力,有些酶原来具有抗原性，这除了酶的结构特点 以外，还由于酶是大分子。 蛋白质的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白质往往出现较强的抗原性，而小分子的肽链或蛋白质，其抗原性较低或者无抗原性。所以，若将酶分子经肽链有限水解，其分子量减小，就会在保持其酶活力的前提下，使酶的抗原性降低，甚至消失。,、降低抗原性：,酶蛋白侧链基团就是指组成蛋白质的氨基 酸残基上的功能团。 通过改变酶蛋白侧链基团而使蛋白质空间结构发生某些改变，从而引起酶的特性和功能改变的方法称为酶蛋白侧链基团修饰。,(4)酶蛋白侧链基团修饰：,氨基修饰剂：能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物。 主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、亚硝酸等。 羧基修饰剂：可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物。 主要有：乙醇-盐酸试剂、水溶性的碳化二亚胺等 胍基修饰剂：可与酶蛋白侧链上的胍基缩合生成稳定杂环的 化合物。 一般是二羰基化合物。主要有：环己 二酮、乙二醛、苯乙二醛等。,常用的小分子侧链基团的修饰剂：,蛋白质的半胱氨酸残基侧链中含有巯基。巯基在许多酶中充当活性中心的催化基团，巯基可与另一巯基形成二硫键，对维持酶的结构稳定性起重要作用。 常用的有二硫苏糖醇、疏基醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。,巯基修饰剂：,蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。 酚基修饰法有：碘化法、硝化法和琥珀酰化法等。 经酚基修饰剂修饰后，酚分子由于引入负电荷，因而增加了对带正电荷的底物的结合力，有利于酶催化功能的发挥。,酚基修饰剂：,分子内交联剂：,用含有双功能团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。,（5）氨基酸置换修饰,通过氨基酸置换修饰，可以提高酶活力或增加酶的稳定性，更有利于酶的应用。,将肽链上的某一氨基酸进行置换而引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。,通过各种物理方法，使酶分子的空间 构象发生改变，从而改变酶的某些特性和 功能的方法称为物理修饰。,（6）物理修饰：,特点：不改变酶的组分和基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键发生某些变化和重排。,第三节 药 物 的 酶 法 生 产,用在半合成抗生素生产上。催化青霉素或头孢霉素水解生成6氨基青霉烷酸（6APA）或7氨基头孢霉酸（7ACA）。又可催化酰基化反应，由6APA合成新型青霉素或由7ACA合成新型头孢霉素。,一、药物的酶法生产中所用酶的种类,1、青霉素酰化酶：催化侧链的水解和合成,化学反应式,不同来源的青霉素酰化酶对温度和pH值的要求不同。同一来源的青霉素酰化酶在催化水解反应和催化合成反应时所要求的条件各不相同，尤其是pH条件相差较大，操作时要控制好。一般说来，催化水解反应时，pH值为7.0 8.0,而催化合成反应时, pH值降低到5.0 7.0.,2、-酪氨酸酶,-酪氨酸酶可催化L-酪氨酸或邻苯二酚生成二羟苯丙氨酸（DOPA，多巴）。,多巴：一种神经传递介质，治疗帕金森 氏综合症（英国医师Parkinson描述的一种大 脑中枢神经系统发生病变的老年性疾病）。,-酪氨酸酶催化酪氨酸生成多巴的条件为： pH3.5-6.0，温度30-55。另外，在催化转化时要添加抗氧化剂，,核苷中的核糖被阿拉伯糖取代可以形成阿糖苷。阿糖苷具有抗癌和抗病毒的作用。其中阿糖腺苷疗效显著。 阿糖腺苷（腺嘌呤阿拉伯糖苷）可由核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷（尿嘧啶阿拉伯糖苷）转化而成。而阿糖尿苷由尿苷（尿嘧啶核苷）通过化学方法转化而成。,3、核苷磷酸化酶：,无色杆菌（Acbrcmobacter lydicus）蛋白酶可以特异性地催化胰岛素B链羧基末端（第30位）上的AA置换反应，由猪胰岛素（Ala-30） 人胰岛素（Thr-30） ，以增加疗效。,4、无色杆菌蛋白酶：,AA排列顺序 A8 A9 A10 B30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 Thr Ser Ile Ala,5、5-磷酸二酯酶,5-磷酸二酯酶催化核糖核酸水解生成四种5-核苷酸，5-核苷酸用于心脏疾病、肝脏疾病等的治疗。,PNP酶 nNDP+RNAn RNAn+1+pi,6、多核苷酸磷酸化酶（PNP酶）,PNP酶催化核苷二磷酸聚合生成多聚核苷酸。,式中NDP为核苷二磷酸， RNAn和 RNAn+1分别为含有n和n+1个核苷酸的 多核苷酸。,若以肌苷二磷酸（IDP）和胞苷二磷酸（CDP）为底物，通过酶的作用，可生成聚肌胞。 聚肌胞是一种高效的干扰素诱导剂，对慢性肝炎、带状疱疹、角膜炎等均有一定的疗效。 PNP酶可由大肠杆菌等多种菌株生产。,1、根据欲制造的药物的结构特点，选择好原料、反应步骤及所使用的酶或酶系。,二、酶的选择与反应条件的优化,2、根据药物的用途和要求，选择的酶需经过一定步骤进行纯化，以达到产品的要求。,3、根据酶的反应动力学特点，确定并优化反应的工艺条件，包括底物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂的浓度等。,4、要求前体物质达到一定的纯度要求并廉价易得，以提高产品质量，降低生产成本。,三、酶和菌体固定化,游离酶的不足：,（1）酶的稳定性较差，在温度、PH值和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。 （2）难于回收利用，不仅使成本较高，而且难于连续化生产。 （3）酶反应后成为杂质与产物混在一起，不利于产物的提纯和精制。,固定化酶（Immobilized Enzyme） : 固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。,将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。,固定在载体上的菌体或菌体碎片称为 固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。,（一）酶和菌体固定化的方法,吸附法 包埋法 共价结合法 交联法,吸附法,吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。,物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。 常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。 离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。 最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。,根据吸附剂的特点分为两种：,吸附法的优点、缺点,优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。 缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落， 会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。,2、包埋法,将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。,凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化菌体。,（1）、凝胶包埋法,聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 ，操作简单经济。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 胶原和明胶也是常用的包埋载体。,2、微囊化包埋法,微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用 。 微囊制备方法 （1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。 （2）界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。 （3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。,包埋法的优点、缺点,优点：在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。 缺点：是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。,共价结合法是目前研究中最为活跃的方