蛋白质的结构与功能-1.ppt

生物化学与分子生物学,刘兴奋,目 录,目 录,第一章 蛋白质的结构与功能 第二章 核酸的结构与功能 第三章 糖复合物 第四章 酶和维生素 第五章 糖代谢 第六章 生物氧化 第七章 脂类代谢 第八章 氨基酸代谢 第九章 核苷酸代谢 第十章 物质代谢的联系与调节 第十一章 血液生物化学 第十二章 肝胆生物化学,第十三章 DNA的生物合成 第十四章 RNA的生物合成 第十五章 蛋白质生物合成 第十六章 基因表达调控 第十七章 细胞信息转导 第十八章 细胞增殖、分化与调亡的分子基础 第十九章 分子生物学常用技术 第二十章 基因工程 第二十一章 基因诊断与基因治疗 第二十三章 基因组学与后基因组学,蛋白质的结构与功能,第 一 章,Structure and Function of Protein,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,Introduction,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,三聚氰胺,1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用（凝血因子等） 3）免疫保护作用（抗体） 4）物质的转运和存储（激素） 5）运动与支持作用（胶原） 6）参与细胞间信息传递（转录因子）,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,3. 氧化供能 酶的作用下氧化生成ATP,蛋 白 质 的 分 子 组 成 The Molecular Component of Protein,第 一 节, 组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。 酪蛋白（含P 0.08 )，血红蛋白（Fe），血蓝蛋白（Cu），锌指蛋白、唾液蛋白（Zn)，精氨酸酶（Mn）。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%, 蛋白质元素组成的特点,一、氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种（编码氨基酸），且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,（一）氨基酸的分类,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,目 录,非极性疏水性氨基酸的特点:,这类氨基酸在水中的溶解度小，当R基趋于增大时，其疏水作用也增强。 疏水作用强的氨基酸常处于蛋白质结构的内部，或在生物膜的疏水环境之中。,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,目 录,极性中性氨基酸的特点：,R基团上有OH、SH或酰胺基等极性基团，在中性水溶液中不解离，但有亲水性，易溶于水。,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,目 录,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,非蛋白质氨基酸,特点：不参与蛋白质的合成，出现在代谢过程中。 如氨基丁酸、鸟氨酸、瓜氨酸等。,（二）氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,pI,2（pK1pK2）,1,2. 紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 275280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,3. 茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，茚三酮被还原，还原产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，再与另一分子茚三酮缩合生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570 nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,二、肽键与肽,* 肽键（peptide bond）是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的酰胺键。,（一）肽键和肽(peptide)的结构,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端 书写时从N端在左，C端在右，氨基酸顺序编号从N端开始。,多肽链有两端,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,主链结构 NCCNC C. 连接于C上的各种残基统称为侧链。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二） 几种生物活性肽（神经传导、代谢调节）,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH的巯基具有还原性，是体内重要的还原剂，保护蛋白质或酶分子中巯基免遭氧化，使蛋白质或酶处于活性状态。 GSH的巯基还有嗜核特性， 能与外源的嗜电子毒物如致癌剂或药物等结合，从而阻断这些化合物与DNA、RNA或蛋白质结合，以保护机体免遭毒物损害。,（氧化型GSH）,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide) 如脑啡肽（5肽）、内啡肽（31肽）、强啡肽（17 肽）、孤啡肽（17肽）、P物质（10肽）、神经肽Y等,2. 多肽类激素及神经肽,催产素（9肽） 加压素（9肽） 促肾上腺皮质激素（39） 促甲状腺素释放激素（3）,3. 其他,有些抗生素也属于肽类或肽的衍生物，例如短杆菌肽S（gramicidin S）、多粘菌素E（polymyxin E）和放线菌素D（actinomycin D）等。某些蕈产生（mushrooms）的剧毒毒素也是肽类化合物，例如-鹅膏蕈碱（ -amanitin)，它能与真核生物的RNA聚合酶II牢固结合而抑制酶的活性。,三、蛋白质的分类,* 根据蛋白质组成成分,单纯蛋白质又根据理化性质及来源分为清蛋白（白蛋白）、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白。,结合蛋白质的辅基有：色素化合物、寡糖、脂类、磷酸、金属离子、核酸。 结合蛋白按其辅基的不同又分为核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、金属蛋白、色蛋白。,类,* 根据蛋白质结构和溶解度分为： 纤维状蛋白（如胶原蛋白、弹性蛋白等，主要作为细胞坚实的支架或连接各细胞、组织或器官。） 球状蛋白（大多具有生理活性，如酶、转运蛋白、蛋白类激素、免疫球蛋白及补体等） 膜蛋白（如酶、7次跨膜的G蛋白偶联受体、离子通道受体、激素受体等，是膜功能的主要体现者。根据膜蛋白与脂分子的结合方式分为整合蛋白、外周蛋白和膜锚定蛋白。）,* 根据蛋白质的功能分为： 活性蛋白（多为球状蛋白，有识别功能。） 非活性蛋白（其保护和支持作用的纤维状蛋白）,蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein,第 二 节,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。这种顺序由基因的碱基序列所决定。,一、蛋白质的一级结构,主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,目 录,多肽链一级结构测定的基本原则： Edman降解法；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）,二、蛋白质的二级结构,主要的化学键： 氢键,（一）肽单元,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（二） -螺旋,目 录,右手螺旋,（三）-折叠,相邻两个肽单元折叠成110o角，两个氨基酸残基占据0.7nm 的长度，形成一个重复单元。,（四）-转角和无规卷曲,-转角：肽段出现180回折时的结构。,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,第二个氨基酸残基常为脯氨酸。,（五）模体,在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体或模序(motif)，也有人称其为超二级结构（super-secondary structure)。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,1个螺旋和2个反向平行的折叠,（六）氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响,蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋或-折叠，它就会出现相应的二级结构。,三、蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一） 定义,目 录,肌红蛋白 (Mb),一种负责运输氧的蛋白。由153个氨基酸残基形成一条肽链和一个血红素辅基构成。,纤连蛋白分子的结构域 每个结构域执行与不同物质结合的功能。,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。 结构域之间的无轨卷曲肽段称为铰链区。,（三）分子伴侣,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,* 分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,* 分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,* 分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)，以、等命名。,血红蛋白的四级结构,2个亚基和2个亚基构成，每个亚基结合一个血红素。具有运输O2和CO2的功能。,蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”,为基因突变所致。,*一级结构相似的多肽或蛋白质具有相似的空间构象及功能。 如胰岛素，不同动物来源的胰岛素，与空间相关的关键氨基酸是相同的。 *一级结构中关键部位氨基酸残基的改变会引起蛋白质功能的异常。,亲水,疏水,血红蛋白,1）变性蛋白质功能丧失 * 变性在某些物理或化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失的现象。 * 蛋白质变性的因素有：化学因素（酸、碱、有机溶剂、尿素、表面活性剂、生物碱试剂以及重金属离子）、物理因素（加热、紫外线、X射线、超声波、高压、剧烈振荡） * 蛋白质的变性具有一定程度的可逆性。,二、蛋白质空间结构与生物学功能,应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,2）变构蛋白质活性调节方式 * 变构一个蛋白质与其配体结合后，蛋白质的空间结构发生改变，使它适合于功能的需要，这一类变化称为变构效应或别构效应。 别构蛋白 别构剂 * 别构剂有：H+、CO2、O2、ATP、AMP等。,肌红蛋白与血红蛋白的结构,目 录,Mb,Hb,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为HbO2。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,血红蛋白的构象变化与结合氧,血红蛋白的别构效应,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,* 协同效应(cooperativity),一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),T态的与氧的 结合力小,R态,血红素与氧结合后，铁原子半径小于孔半径，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,3）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,第四节,蛋白质的理化性质与分离纯化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein,（一）蛋白质的两性电离,一、理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万Da之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 受水的影响，蛋白质疏水性的R基团多位于分子内部，颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集。 蛋白质分子表面的可解离基团的解离，使其在溶液中带有一定量的同种电荷，分子间相互排斥，不能相互聚集而沉淀析出。,* 蛋白质胶体稳定的因素 水化膜 颗粒表面电荷,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 常用的沉淀剂有：中性盐、有机溶剂、重金属盐及生物碱试剂等。 沉淀蛋白质的方法有：盐析、有机溶剂沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂沉淀等。,（三）蛋白质的沉淀和凝固,* 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 不可逆,（四）蛋白质的紫外吸收,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,（五）蛋白质的呈色反应,2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 在pH57的溶液中，蛋白质分子中游离的氨基可与茚三酮反应。 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,Folin-酚试剂反应 蛋白质中含带有酚羟基的酪氨酸残基，在碱性条件下，能与酚试剂（磷钼酸与磷钨酸的混合物）反应生成蓝色化合物（钼蓝）。,3. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,二、蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到分离、纯化和浓缩蛋白质溶液的目的。 根据所加压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋