蛋白质的电化学分析研究进展.ppt

蛋白质的电化学分析研究进展,报告人：王 庚,一、蛋白质的测定,在蛋白质结构和功能研究中,通常需要知道蛋白质溶液的准确浓度。 同时,蛋白质含量的测定在药物、食品及临床分析中也具有重要意义。,目前,研究测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、光化学分析法、免疫法、液相色谱法、电化学分析法等。其中分光光度法、荧光法、光散射技术等光学分析法测定蛋白质含量的方法是蛋白质测定研究最活跃的领域之一1,2 ,而以电化学分析法对蛋白质进行研究相对较少3 。,蛋白质的电化学行为研究,直接电化学分析 间接电化学分析,具体又分为 蛋白质的极谱分析 催化氢波 小分子电化学探针等,二、蛋白质的直接电化学分析,蛋白质的极谱分析 蛋白质在固体电极上的电化学行为,蛋白质的极谱分析,蛋白质自身的极谱波主要产生于分子内的双硫键或硫基。一般来说蛋白质可以产生3个双硫键的可逆还原波,其中2个双硫键与汞电极生成汞硫醇盐、亚汞硫醇盐的表面还原波,峰电位分别约为-0.25V 和-0.50V。另一个为受扩散控制的双硫键还原波,峰电位为-0.90V。,Cecil4等人对胰岛素等多种含双硫键的蛋白质的极谱还原波进行了研究,结果表明每种蛋白质的极谱行为会因pH不同而各异。但在pH1.0时,所有含双硫键的蛋白质在-0.25V左右只产生一个还原波,此还原波电流随蛋白质的浓度增加而达到一极限值,极限电流与分子中双硫键数目有关。胱胺酸、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白IgA及IgG、a-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶等蛋白质分子中双硫键的电极还原机理也被详细研究。,蛋白质在固体电极上的电化学行为,由于蛋白质的空间结构庞大,电活性中心深埋于多肽键的内部难以直接与电极表面交换电子,且蛋白质易在电极表面强烈吸附造成电极钝化和蛋白质的变性,因此难以得到有效的电极响应,对蛋白质在裸电极上的电化学行为研究造成一定的阻力。 人们在不断采用各种手段来进行研究,研究对象多集中于血红蛋白、辣根过氧化物酶、细胞色素C、肌红蛋白等氧化还原蛋白质。,早期方法：加入媒介剂和促进剂,最早方法：采用合适的媒介剂和促进剂来加速电极上的电子交换速率。 机理：初步认为促进剂和媒介剂能与蛋白质相互作用形成复合物使多肽链被伸展,疏水结构被打开而使电活性中心被暴露在电极表面。 常用的促进剂：金属络阳离子、双官能团试剂、表面活性剂等。,林琳5等人发现血红蛋白在pH = 5.0 的0.3mol/L NaAc HAc 缓冲溶液中,于+ 0.4 -0.1V 范围内循环扫描,会产生一对氧化还原峰,在四甲基氯化铵促进下裸银电极测定血红蛋白时,峰电位之差为0.14V ,氧化还原峰电流与血红蛋白浓度在2.010-7mol/ L1.510-6mol/L 范围内有良好的线性关系。,何亚楠6等利用十二烷基硫酸钠做为促进剂在裸银电极上测定血红蛋白,可以得到良好的电流响应。血红蛋白氧化峰电流与其浓度成正比,浓度范围5.010-7mol/ L5.0 10-8mol/ L ,可直接用于血红蛋白的分析测定。,利用修饰电极,在电极表面按照人们的意图设计固定上一些有特定功能的官能团,可以达到对待测物质的分子识别。 已用的修饰电极：自组装单层膜修饰电极、生物膜模拟修饰电极、堆积双层膜修饰电极、无机材料双层膜修饰电极、LB 膜修饰电极等。这些修饰电极的构造目的都是使蛋白质的构象和空间取向等利于使电活性中心更加接近于电极表面,从而实现二者之间的直接电子转移10-12。,三、蛋白质的催化氢波,催化氢波的产生： H+(H3O+)在汞电极上有很大的超电压,当某些有机物或金属络合物存在时能降低H+ 的超电位而产生催化氢波。,蛋白质的催化氢波的分类,蛋白质自身的“钠前催化氢波” 金属离子存在时蛋白质的催化氢波,测定原理,催化氢波电流与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系,可用于蛋白质的检测分析。,宋俊峰7-9等人报道了一种蛋白质硫键的有机平行催化波。在氧化剂如KIO3 、K2S2O8 和H2O2 等存在下人血清白蛋白(HSA) 、溶菌酶等蛋白质的催化氢波能被进一步催化产生新的动力波,该动力波是一种氢的平行催化波,它是由氢离子电化学还原和上述氧化剂氧化中间产物原子氢使其化学再生而产生的。,四、蛋白质与小分子 相互作用的电化学研究,蛋白质与有机小分子结合方式多种多样。 现在普遍认为： 在蛋白质的碱性氨基酸的残基中,精氨酸和赖氨酸 残基上的NH4+ 与染料离子上的SO3-靠静电引力相 结合; 在蛋白质的疏水氨基酸中,色氨酸残基与疏水阴离 子靠疏水作用相结合。,在许多情况下,蛋白质与有机小分子反 应不仅是某一种力的单独作用,而是多种力 协同作用的结果。这些力包括静电引力、 疏水作用力、范德华力等。 其中,静电力起着重要作用。,焦奎10-13等人开展了蛋白质的电化学探针的研究工作,选择多种具有电活性的物质作为探针,考察其与蛋白质相互作用的模式,并建立了检测蛋白质的电化学新方法。以铍试剂III为电化学探针,检测人血清白蛋白的线性范围为1.0mol/L40.0mg/L ,可用于人血清白蛋白、牛血清白蛋白的测定。,另外,对溴甲酚绿、溴甲酚紫、溴百里香酚蓝等电化学探针与蛋白质作用的电化学行为也进行了详细的研究,建立了电活性探针与蛋白质相互结合的模型,探讨了相互作用的机理。韩英强14等报道了蛋白质- 荧光素复合物单扫极谱波的形成条件,复合物使荧光素在-5.58V处的还原峰电流增大,峰电流的增大值与加入的BSA 或HSA的浓度在一定范围内呈线性关系。罗登柏15等人研究了金属离子与蛋白质相互作用后形成的稳定配合物的极谱行为。,五、展望, 蛋白质的仿生电化学; 蛋白质结构与功能的电化学表征; 蛋白质与外源分子作用机理的电化学研究; 利用蛋白质如酶的催化活性高灵敏电化学 新方法的研究。,参考文献,1 杨睿,刘绍璞. 分析化学,2001 ,29(2):232-241. 2 王亚婷,赵凤林,李克安,等. 高等学校化学学报,2000,21(10):1491-1497. 3 刘利民,郭新春等.井冈山师范学院学报(自然科版),2001,22(6):10-13. 4 Cecil R ,Weitzman P D J . Biocham. J . 1964 ,93 :1 - 11. 5林琳,张珂. 分析化学,1996 ,24(11) :1281 - 1283. 6何亚楠,李根喜,史海蓉,等. 1997 ,25(1) :49 - 51. 7刘利民,过玮,宋俊峰. 分析化学,2002 ,30(1) :46 - 49. 8过玮,杨亚妮,宋俊峰. 高等学校化学学报,2000 ,21(2) :198 - 201. 9过玮,刘利民,林洪,等. 中国科学(B 辑) ,2001 ,31 (6)519 - 524. 10孙伟,焦奎,刘晓云. 分析化学,2002 ,30(3) :312 - 314. 11王学亮,孙伟,焦奎.广西师范大学学报(自然科版),2003,21(4)特刊:61-62。 12孙伟,焦奎.第八届全国电分析化学学术会议论文集,兰州,甘肃文化出版社,2002,158-15