蛋白质的共价结构-1.ppt

第三节 蛋白质的共价结构(一级结构）,一 肽与肽键的结构 二 肽的物理和化学性质 三 天然存在的活性肽 四 蛋白质一级结构的测定 蛋白质的一级结构与生物功能,一级结构:多肽链的氨基酸序列,基本要求 1.肽的结构特点、基本性质 2.蛋白质一级结构测定方法 3.一级结构与生物功能关系，有关典型例子,一 肽与肽键的结构： 肽（peptide）：aa的线性聚合物,也称肽链。 肽键（peptide bond）：连接多肽链主链中氨基 酸残基共价键 二肽：2个aa以肽键相连 寡肽(oligopeptide)：含几个到十几个aa的肽链 多肽(polypeptide)：含20个以上aa的肽链 环肽,一 肽与肽键的结构： 氨基酸残基（amino acid residues） 肽链的极性 N-端（左）、C-端（右） 多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端。另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸序列是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。 肽基 (peptide group): 也称肽单位,肽链中的酰氨基 (-CO-NH-),（酰氨键） 肽键：AA间脱水后形成的共价键,肽的命名 Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu 丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸（五肽）,Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser ?,肽,甘氨酸残基,主干链: N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C-N-C-C,肽,肽链极性,由CO和NH构成肽键的四个原子和与之相连的两个-碳原子构成的刚性平面,肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。,肽平面的形成 见p164图42,肽键的C和N均为sp2杂化，有部分双键的性质，相关的6个原子处于共平面,肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。,肽平面的形成 见p164图4-2,肽平面结构特征:,肽键长=1.33A，具部分 双键性质，不能自由旋转 肽平面上的六个原子 倾向于共平面，因此肽平面具有刚性 在肽平面中C=O与NH 或两个C呈反式排布。 除Pro外，NC（）和CC（）都是单键，可以绕键轴自由旋转，其旋转角度分别用和表示，称为二面角（dihedral angle）,N,C,O,H,C,C,115.6,121.9,123.2,119.5,肽平面示意图,肽平面：也称肽基平面、酰胺平面。 肽键的平面性质在肽链折叠成三维结构中是很重要的。,（二） 肽的理化性质,1 酸碱性： 肽链中末端-羧基的pKa值比游离氨基酸中的大；末端-氨基的pKa值比游离氨基酸中的小。 肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带电荷情况，再统计净电荷的量（P166表4-6）。,（二） 肽的理化性质,. 化学反应: 化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存在,肽可以进行双缩脲反应。 茚三酮反应: 双缩脲反应：肽和蛋白质特有，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。,（二） 肽的理化性质,. 化学反应:,双缩脲（H2NOCNHCONH2）,（二） 肽的理化性质,. 化学反应:,双缩脲,双缩脲与铜离子的络合物,双缩脲在碱性溶液（NaOH）中，能与铜离子（Cu2+）作用，形成紫色络合物，该反应即双缩脲反应。,（二） 肽的理化性质,. 化学反应:,由于多肽和蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应,多肽或蛋白质与铜离子的络合物部分结构,（二） 肽的理化性质,3 旋光性质： 小肽：各氨基酸旋光度之和 长肽和蛋白：不是简单加和,（三）天然存在的活性肽,类别：肽类激素、肽类抗生素和肽类毒素,实例：短杆菌肽（抗生素） 谷胱甘肽： - 谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 GSH（还原型）：三肽 GSSG（氧化型）：六肽 脑啡肽：五肽，神经系统 鹅膏蕈碱：环八肽 鹅肌肽（-Ala-1-甲基-his) 二肽 肌肽（-Ala-his) 二肽,（三）天然存在的活性肽,GSH（还原型） 三肽,GSSG（氧化型） 六肽,Glu- -Cys-Gly | S | S | Glu- -Cys-Gly,生理功能,解毒作用 与毒物或药物结合，消除毒性 参与氧化还原反应 保护巯基酶的活性 使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态 维持红细胞膜结构的稳定： 消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用,L-Aspartyl-L-phenylalanine methyl ester,阿斯巴甜Aspartame,天冬酰胺苯丙氨酸甲酯,一种比蔗糖甜200倍的甜味剂,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-脑啡肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-脑啡肽,均为9肽，仅2个氨基酸有差别，生理功能差别极大。,抗革兰氏阳性菌 治疗化脓性病症,蛋白质 氨基酸残基数在50个以上，具有特定空间结构的肽。 多肽 氨基酸残基数在50个以下，无特定空间结构的肽。,蛋白质与多肽的区别,三、蛋白质一级结构的测定,测定的战略：片段重叠法,一级结构是研究高级结构的基础； 从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系； 为生物进化理论提供依据； 为人工合成蛋白质提供参考。,测定蛋白质一级结构的主要意义：,二硫键的数目和位置,蛋白质的一级结构 (Primary structure),组成蛋白质的多肽链数目,多肽链的氨基酸顺序,1 测定多肽链的数目,2 拆分多肽链,3 断开多肽链内的二 硫键,4 测定每一肽链的氨 基酸组成,5 鉴定多肽链的N-末端和C-末端,6 裂解多肽链为较小的肽段,7 测定各肽段的氨基酸序列,8 重建完整多肽链的一级结构,9 确定二硫键的位置,相对分子量的确定,待测样品纯度鉴定 97以上,准备工作,(一) 策略,准备工作（一）： 样品的分离纯化和纯度鉴定 纯度97% 检测蛋白质样品纯度的方法： （1）电泳 （2）层析 （3）N-末端氨基酸的测定 （4）等电点沉淀 （5）纯化至恒定的比活,准备工作（二）： 确定相对分子量 误差10% （1）凝胶过滤 （2）沉降分析法 （3）SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）,分子总的相对分子质量,每个亚基的相对分子质量,测定要求,A.纯：97% B.分子量 C.亚基数量 D.测定氨基酸组成； 计算每种氨基酸的个数 E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量,1、测定蛋白质分子中多肽链的数目 测定末端AA的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系 确定多肽链的数目,（二）测定步骤,2、多肽链的拆分 多条多肽链组成的蛋白质分子，必须拆分,2. 多肽链的拆离 P171 1).亚基拆分: PH改变: PH10 ; PH3 强变性剂：脲 （8M）； 盐酸胍（6M） 高浓盐 2).二硫键拆分 氧化: 过甲酸，不再重新生成 -S-S- 还原: DTT；巯基乙醇 加碘乙酸等烷基化试剂封闭SH 烷基化试剂：碘乙酸，碘乙酰胺，环乙烯亚胺 3).肽链分离和鉴定 分离: 层析 电泳 鉴定: SDS-PAGE；N-末端分析,寡聚蛋白质：多肽链以非共价键连接 血红蛋白（四聚体）、烯醇化酶（二聚体） 8mol/L尿素 6mol/L盐酸胍,多肽链以共价键连接 胰岛素：过甲酸氧化 -巯基乙醇还原,1).亚基拆分:,2） 二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联 8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下 过量的-巯基乙醇处理 二硫键还原为巯基 烷基化试剂保护巯基，防止重氧化,-S-S-共价交联 肽链的拆分,氧化法,还原法,3. 肽链aa组成的测定： 1)蛋白水解: 酸解法；碱解法； 5.7N恒沸HCL Trp100%被破坏 酸解：Pr溶液 105-11020-72h 二硫键解离 Asn Gln Asp Glu Ser Thr Tyr Lys部分破坏 2) aa定性和定量： 定性: 纸层析；薄层层析；高压纸电泳 定量：柱层析(离子交换原理),3、测定各多肽链的AA组成 并计算出氨基酸成分的分子比,末端氨基酸：N-端A(amino-terminal)、C-端AA 最重要的是N-端AA分析法, 二硝基氟苯（DNFB）法,Sanger法：2,4-二硝基氟苯与N-端的游离氨基作用，生成 二硝基苯衍生物（DNP）.,酸性条件下水解，黄色DNP-氨基酸，乙醚抽提分离；色谱法鉴定。,丹磺酰氯与N-端AA的游离氨基作用，丹磺酰-AA 优点：丹磺酰-AA强荧光，检测灵敏度达10-9mol, 丹磺酰氯法,C-端AA分析法 多肽与肼在无水条件下加热，C-端AA即从肽链上解离 其余的AA生成肼化物 肼化物与苯甲醛缩合成不溶于水的物质与C-端氨基酸分离, 肼解法,氨肽酶：肽链外切酶，从多肽链的N-端逐个水解 根据不同的反应时间，水解出AA种类和数量 确定N-末端残基顺序 亮氨酸氨肽酶,氨肽酶法,C-端逐个水解 根据不同反应时间测出酶水解释放的AA种类和数量 确定C-末端残基顺序 A,B,C，Y； 羧肽酶A：水解除Pro,Arg和Lys外的C-末端氨基酸残基 B：水解Arg和Lys为C-末端的残基,羧肽酶法,酶解法 胰蛋白酶 水解Lys Arg羧基形成的肽键。 糜蛋白酶 水解Tyr Phe Trp羧基形成的肽键。 胃蛋白酶 水解肽键的两侧AA均为疏水性AA. 金黄色葡萄球菌菌蛋白酶 水解Glu Asp羧基形成的肽键。 梭状芽孢杆菌蛋白酶 水解Arg羧基形成的肽键。 羧肽酶 从羧基端开始逐一水解AA的酶 氨肽酶 从氨基端开始逐一水解AA的酶,化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法：选择性地降解Met的-COOH形成的肽键,7、测定每个肽段的氨基酸顺序,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法： N-端分析法。 特点：重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一标记解离,8、确定肽段在多肽链中的次序,利用两套或多套肽段的AA顺序彼此交错重叠 拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序,9、确定原多肽链中二硫键的位置,胃蛋白酶处理未断开二硫键的多肽链 双向电泳分离各肽段，过甲酸处理，分析每个肽段组成及顺序，同其它分析肽段的方法进行比较，确定二硫键的位置,10、蛋白质序列数据库,1.欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；,2.美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验,3.美国政府支持的Gen Bank和欧洲的 EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息,四、Pr 的AA序列与生物功能,（一） 同源Pr的物种差异与生物进化,同源蛋白质（homologous protein）,进化上相关的一组蛋白质 在不同物种中行使着相同功能的蛋白质 不同物种：长度相同或相近,细胞色素C的物种差异,细胞色素C：含铁线粒体蛋白质，生物氧化中传递电子,不变残基（invariant residue）： 重要残基，决定蛋白质特殊生物学活性,可变残基（variable residue） 两个物种同源蛋白质差异数与进化差异程度成正比,104个氨基酸 12，500 D,一级结构是空间构象的基础,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,一级结构中“关键”部分相同,其功能相同,一级结构不同，生物学功能各异 （催产素与抗利尿激素）,一级结构变化与疾病的产生-分子病 如：镰刀状红细胞性贫血 Hb： 6位Glu Val,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,1.氧合血红蛋白,鲸精子肌红蛋白,2. 丝