酶、细胞、原生质体固定化.ppt

Chapter 5 酶、细胞、原生质体固定化与应用,Section 1 酶的固定化概述,一、固定化酶的发展史,二、什么是固定化酶,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶 （固定化酶）,固定化技术,Section 2 固定化酶的制备与特性 一、固定化酶的制备方法 1吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。 物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 2包埋法 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。,包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。 3结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。 4交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。,常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。 5热处理法 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。,二、固定化酶的特性 1稳定性： (1) 对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度； (2) 保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间； (3) 对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解； (4) 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。 2最适温度： 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。例如，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最适温度比游离酶高510等。,3最适PH值： 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 4底物特异性： 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。,Section 3 微生物、植物和动物细胞固定化,一、细胞固定化的方法 1吸附法 利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。 用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等。 2包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。,以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶包埋法。细胞经包埋固定化后，被限制在凝胶的微孔内进行生长、繁殖和新陈代谢。 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。 凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等。 如：琼脂凝胶包埋法 将一定量的琼脂加到一定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至4855，加入一定量的细胞悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球状固定化细胞胶粒，分离后洗净备用。,二、固定化微生物细胞的特点 固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。 固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。 发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。例如，用海藻酸钙凝胶包埋法制备的黑曲霉细胞，用于生产糖化酶可以连续使用一个月。, 固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。如海藻酸钙凝胶固定化黑曲霉细胞生产糖化酶，产率提高30%以上。用中空纤维固定化大肠杆菌生产-酰胺酶，产率提高20倍。 提高工程菌的质粒稳定性。,三、植物细胞固定化 1固定化植物细胞具有下列特点： 植物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响，提高植物细胞的存活率和稳定性。 细胞经固定化后，被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。 固定化植物细胞发酵可以简便地在不同的培养阶段更换不同的培养液，即首先在生长培养基中生长增殖，在达到一定的细胞密度后，改换成发酵培养基，以利于生产各种所需的刺激代谢物。, 固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。 固定化植物细胞易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。 2植物细胞固定化的方法： 吸附法：是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内，或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。例如，将洗净、灭菌后的泡沫塑料粒放进辣椒细胞的培养液中，振荡培养一段时间，辣椒细胞则吸附在泡沫塑料的孔洞内，并在其中进行生长繁殖和新陈代谢。采用中空纤维为载体进行植物细胞固定化是具有美好前景的方法。,包埋法：是将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中。 包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同。此法已在植物细胞固定化，以及发酵生产刺激代谢物方面广泛应用。 1979年，Brodelius等人首次用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化长春花细胞、毛地黄细胞和海巴戟细胞，开创了植物细胞固定化的研究。,四、动物细胞固定化 1固定化动物细胞有下列特点： 提高细胞存活率：动物细胞经固定化后，由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体表面生长，从而可显著提高动物细胞的存活率。 提高产率：动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度。然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提高产率。, 固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间。例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)生产人干扰素可以稳定地生产30 d。 固定化细胞易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。,2动物细胞固定化的方法： 吸附法： 大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中，必须趋向于附着在固体表面。故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化。此法操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究和使用的方法。常用的吸附固定化载体有转瓶、微载体和中空纤维等。 包埋法： 包埋法已成功地用于动物细胞固定化。包埋固定化法一般适用于悬浮细胞。根据载体和方法的不同，有凝胶包埋法、半透膜包埋法两种。,Section 4 原生质体固定化,一、原生质体的制备 一般说来，原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中。然后加入适宜的细胞壁水解酶，在一定的条件下作用一段时间，使细胞壁破坏。分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，而得到原生质体。,二、原生质体固定化 原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。 原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等。 如，海藻酸钙凝胶固定化法：用含有渗透压稳定剂的缓冲溶液配制成一定含量的(36)海藻酸钠溶液，与等体积的一定浓度的原生质体悬浮液混合均匀，将此混悬液用滴管或注射器滴到一定浓度的氯化钙溶液中，浸泡12 h，制成直径为14 mm的球状固定化原生质体。,Section 5 固定化技术的应用,一、固定化酶的应用 1固定化酶在工业生产中的应用 如，氨基酰化酶 ；这是世界上第一种工业化生产的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。,2固定化酶在酶传感器方面的应用 酶传感器是由固定化酶与能量转换器(电极、场效应管