GB8381-1987饲料中黄曲霉素B1的测定方法.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准U DC 6 3 6 . 0 8 5 , 5 4 3 . 0 6 2饲料中黄曲霉素B : 的测定方法GB 8381一 87Th e me t h o d o f d e t e r mi n a t i o n o fa f l a t o x i n B , i n f e e d s t u f f本标准参照采用国际标准 I S O 6 6 5 1 - 1 9 8 3 ( E ) 饲料中黄曲霉素 B ， 的测定方法 。1 适用范围本标准适用于各种单一饲料和配合饲料。2 原理 样品中黄曲霉素B , 经提取、 柱层析、 洗脱、 浓缩、 薄层分离后色荧光， 根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。在波长3 6 5 n m紫外灯光下产生蓝紫3 试剂 3 1三氯甲烷( G B 6 8 2 - 7 8 ) ,正己烷( H G 3 - 1 0 0 3 - 7 6 ) .甲醉( G B 6 8 3 - 7 9 ) ,苯( G B 6 9 0 - 7 7 ) ,乙睛( H G B 3 3 2 9 - 6 0 ) 。无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水( H G B 1 0 0 2 -7 6 ) ,丙酮( G B 6 8 6 - 7 8 )323.55.4抓3637 以上试剂于试验时先进行一次试剂空白试验， 如不干扰测定即可使用。否则需逐一检查进行重蒸。 3 . 8 苯 一 乙腋混合液: 量取 9 8 m l , 苯， 加2 m L乙睛混匀。 3 . 9 三氯甲烷 一 甲醇混合液: 取9 7 m l , 三抓甲烷， 3 m l , 甲醉混匀。 3 . 1 0 硅胶: 柱层析用 8 0 2 0 0目。 3 . 1 1 硅胶G; 薄层色谱用。 3 . 1 2 三氟乙酸。 3 . 1 3 无水硫酸钠( H G 3 - 1 2 3 - 7 6 ) , 3 . 1 4 硅藻土。 3 . 1 5 黄曲霉毒素B ， 标准溶液 3 . 1 5 . 1 仪器校正: 测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数， 以求出使用仪器的校正因素: 精密称取2 5 m g经千燥的重铬酸钾( 基准级) 。用。 . 0 0 9 m o l / L 硫酸溶解后准确稀释至2 0 0 m l , ( 相当于0 . 0 0 0 4 m o l / L 的溶液) 再吸取 2 5 m l . 此稀释液于 5 0 m l , 容量瓶中， 加 。 . 0 0 9 m o l / L硫酸稀释至刻度 ( 相当于0 . 0 0 0 2 m o l / L 溶 液 ) 。 再 吸 取2 5 m L 此 稀 释 液 于5 0 m l. 容 量 瓶 中 ， 力 J 0 . 0 0 9 m o l / L 硫 酸 稀 释 至 刻 度( 相 当于0 . 0 0 0 1 m o l / L溶液) 。用 l c m石英杯， 在最大吸收峰的波长处( 接近 3 5 0 n m) 用 0 . 0 0 9 m o 1 / L硫酸作空白， 测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸光度。并按下式计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平中华人民共和国农牧渔业部 1 9 8 7 一 1 1 一 2 0 批准1 9 8 8 一 1 2 一 0 1 实施免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB 83 81一 8 7均值。F . =二式中: F A一一重铬酸钾溶液的摩尔消光系数;一测得重铬酸钾溶液的吸光度;”一一重铬酸钾溶液的摩尔浓度再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值 3 1 6 0比较， 按下式求出使用仪器的校正因素。了-3 1 6 0M (2)式中: f - 一 使用仪器的校正因素; M- 一测得重铬酸钾摩尔消光系数平均值。若f 大于。 . 9 5 或小于1 . 0 5 ， 则使用仪器的校正因素可略而不计。 3 . 1 5 . 2 1 0 p g / m L 黄曲霉毒素B 、 标准溶液的制备: 精密称取 1 m g -1 . 2 m g 黄曲霉毒素B , 标准品，先加入 2 m L的乙睛溶解后， 再用苯稀释至 1 0 0 m L , 置于 4冰箱保存。 用紫外分 光光度 计M ail 此标准溶液的 最大吸 收峰的波长及该迪长的吸光 度值， 并 按下式计算该 标准溶液的浓度。X , = A X M X 1 0 0 0 X fE ,式中 X ,一 黄曲霉毒素B标准溶液的浓度， p g / m L ; A一一测得的吸光度值; M一一黄曲霉毒素B ， 的分子量, 3 1 2 ; F . ， 一 一 黄曲霉毒素B ， 在苯一 乙睛棍合液中的摩尔消光系数， 1 9 8 0 0 , 根据计算， 用苯一 乙睛混合液调到标准液浓度恰为1 0 p g / m L ， 并用分光光度计核对其浓度 3 . 1 5 . 3薄层板上。纯度的测定: 取 5 p L 1 0 ! , 哪m L黄曲霉毒素B . 标准溶液滴加于涂层厚度0 . 2 5 m m的硅胶G用甲醇一氯仿( 4 : 9 6 ) 与丙酮 : 氯仿( 8 : 9 2 ) 展开剂展开， 在紫外光灯下观察荧光的产生， 必须符合以下条件: a . 在展开后， 只有单一的荧光点， 无其他杂质荧光点。 6 . 原点上没有任何残留的荧光物质 3 . 1 6 黄曲霉毒素B ， 标准使用液: 精密吸取1 m L 1 0 p g / m L标准溶液于 1 0 m L 容量瓶中， 加苯一 乙睛混合液至刻度， 混匀， 此溶液每毫升相当于1 p g 黄曲霉毒素B , 。吸取 1 . 0 m L 此稀释液置于5 m L 容量瓶中. 加苯 乙睛混合液稀释至刻度 此溶液每毫升相当于0 . 2 N g 黄曲霉毒素B , 。另吸取1 . 0 m L 此液置于5 m L 容量瓶中， 加苯一 乙睛混合液稀释至刻度。此溶液每毫升相当于0 . 0 4 u g 黄曲霉毒素B , . 3 . 1 7 次氯酸钠溶液( 消毒用) : 取1 0 0 g 漂白粉， 加入5 0 0 m L 水， 搅拌均匀。另将 8 0 g 工业用碳酸钠( N a ,C O , I O H , O ) 溶于5 0 0 m L 温水中， 再将两液混合， 搅拌、 澄清后过滤。此滤液含次氯酸钠浓度约为2 . 5 %,若用漂白粉精制备则碳酸钠的量可以加倍。所得溶液的浓度约为5 %， 污染的玻璃仪器用l %次氯酸钠溶液浸泡半天或用5 %次氯酸钠溶液浸泡片刻后即可达到去毒效果口4 仪器东1 小型粉碎机。4 . 2 分样筛一套4 . 3 电动振荡器。4 . 4 层析管内径2 2 m m， 长3 0 0 m m45 玻璃板: 5 x2 。 c m4 . 6 傅层板涂布器 ( 川下带活塞， 上有贮液器免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB 8381一 874 . 7 展开槽: 内长2 5 c m 、 宽6 c m 、 高 4 c m4 . 8 紫外光灯: 波长 3 6 5 m n ,4 . 9 天平。4 . 1 0 具塞刻度试管1 0 . 0 M L , 2 . 0 M L .4 . 1 1 旋转蒸发器或蒸发皿。4 . 1 2 微量注射器或血色素吸管。5 操作方法5 . 1 取样 样品中污染黄曲霉毒素高的毒粒可以左右测定结果。而且有毒霉粒的比例小， 同时分布不均匀。为避免取样带来的误差必须大量取样， 并将该大量粉碎样品混合均匀， 才有可能得到确能代表一批样品的相对可靠的结果， 因此采样必须注意。 5 . 1 . 1 根据规定检取有代表性样品。 5 . 1 . 2 对局部发舞变质的样品要检验时， 应单独取样检验。 5 . 1 . 3 每份分析测定用的样品应用大样经粗碎与连续多次四分法缩减至0 . 5 - - 1 k g ， 全部粉碎样品全部通过2 0目筛， 混匀， 取样时应搅拌均匀。必要时， 每批样品可采取三份大样作样品制备及分析测定用。 以观察所采样品是否具有一定的代表性。 5 . 2 样品的制备 如果样品脂肪含量超过 5 %， 粉碎前应脱脂。如果经脱脂， 分析结果以未脱脂样品计。 5 . 3 提取 取2 0 g 制备样品， 置于磨口锥形烧瓶中， 加硅藻土( 3 . 1 4 ) 1 0 g ， 水 1 0 m L ， 三氯甲烷( 3 . 1 ) 1 0 0 m L ， 加塞， 在振荡器上振荡3 0 m i n ， 用滤纸过滤， 滤液至少5 0 m L , 5 . 4 柱层析纯化 5 . 4 . 1 柱的制备 柱中加三氯甲烷( 3 . 1 ) 约2 / 3 ， 加无水硫酸钠( 3 . 1 3 ) 5 8 ， 使表面平整， 小量慢加柱层析硅胶( 3 . 1 0 )l o g ， 小心排除气泡， 静止 1 5 m i n ， 再慢慢加入 1 0 g 无水硫酸钠， 打开活塞， 让液体流下， 直至液体到达硫酸钠层上表面， 关闭活塞。 5 . 4 . 2 纯化 用移液管取 5 0 m L滤液， 放入烧杯中， 加正己烷( 3 . 2 ) 1 0 0 m L , 混合均匀， 把混合液定量转移至层析柱中， 用正己 烷洗 涤烧杯倒人柱中。 打开活塞， 使液体以8 - 5 2 m L / m i n 流下， 直至到 达硫酸钠层上 表面， 再把 l O O m L乙醚( 3 . 6 ) 倒人柱子， 使液体再流至硫酸钠层上表面， 弃去以上收集液体。整个过程保证柱不二 干 用三氯甲 烷一 甲 醉液( 3 . 9 ) 1 5 0 m L 洗脱柱子， 用旋转蒸发器烧瓶收集全部洗脱液。 在5 0 以下减压蒸馏， 用苯一 乙腊混合液( 3 . 8 ) 定量转移残留物到刻度试管中， 经5 0 以下水浴气流挥发， 使液体体积到2 . O m L 为止。洗脱液也可在蒸发皿中经5 0 C 以下水浴气流挥发干， 再用苯一 乙睛转移至具塞刻度试管中。 如用小口径层析管进行层析， 则全部试剂按层析管内径平方之比缩小。 5 . 5 单向展开法测定 5 . 5 . 1 薄层板的制备: 称取约 3 g硅胶 G ( 3 . 1 1 ) ， 加相当于硅胶量二至三倍左右的水， 用力研磨1 -2 m i n至成糊状后立即倒入涂布器内， 推成 5 X2 0 c m, 厚度约0 . 2 5 m m的薄层板三块。在空气中干燥约 1 5 m i n ， 在 1 0 0活化2 h ， 取出放干， 于干燥器中保存。一 般可保存二至三天， 若放置时间较长，可再活化后使用 5 . 5 . 2 点样: 将薄层板边缘附着的吸附剂刮净， 在距薄层板下端 3 c m的基线上用微量注射器或血色免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B 8 3 8 1一 8 7素吸管滴加样液。一块板可滴加四个点， 点距边缘和点间距约为 1 c m， 点直径约3 m 。 在同一块上滴加点的大小应一致， 滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下: 第一点 1 0 P L O . 0 4 4 g / m L 黄曲霉毒素B ， 标准使用液; 第二点: 1 6 P L样液; 第三点: 1 6 P L 样液+1 0 P L O . 0 4 P g / m L 黄曲霉毒素B ， 标准使用液; 第四点: 1 6 P L 样液- 1- 1 0 P L O . 2 P L / m L 黄曲霉毒素B 。 标准使用液 5 . 5 . 3 展开与观察: 在展开槽内加 1 0 m L无水乙醚预展 1 2 c m， 取出挥干， 再于另一展开槽内加 1 0m L 丙酮 一 三氯甲烷( 8 : 9 2 ) , 展开1 0 - 1 2 c m ， 取出， 在紫外光灯下观察结果. 方法如下 a 由于样液点上加滴黄曲霉毒素B 、 标准使用液， 可使黄曲霉毒素B , 标准点与样液中的黄曲霉毒素B , 荧光点重叠。 如样液为阴 性， 薄层板上的第三点中黄曲 霉毒素B . 为。 . 0 0 0 4 P g ， 可用作检查在样液内 黄曲霉毒素B ， 最低检出量是否正常出现; 如为阳性， 则起定位作用。 薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B为0 . 0 0 2 P g ， 主要起定位作用。 b . 若第二点在与黄曲霉毒素B 、 标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点， 表示样品中黄曲霉毒素B ,含量在5 P g / k g 以下; 如在相应位置上有蓝紫色荧光点， 则需进行确证试验。 5 . 5 . 4 确证试验: 为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B 、 产生的， 加滴三氟乙酸， 产生黄曲霉毒素B的衍生物， 展开后此衍生物的比移值约在0 . 1 左右。 方法 于薄层板左边依次滴加两个点。 第一点: l 6 4 L样液; 第二点: 1 0 P L O . 0 4 4 g 加L 黄曲 霉毒素B ， 标准使用液; 于以上两点各加1 小滴三氟乙酸( 3 . 1 2 ) 盖于样点上， 反应5 m i n 后， 用吹风机吹热风2 m i n ， 使热风吹到薄层板上的温度不高于4 0 C。再于薄层板上滴加以下两个点; 第三点: 1 6 P L样液; 第四点: L O P L O . 0 4 P g / m L 黄曲霉毒素B 、 标准使用液 再展开同前。在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B . 标准点相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、 四两点， 可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。 5 . 5 . 5 稀释定量: 样液中的黄曲霉毒素B , 荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B标准点的最低检出量( 0 . 0 0 0 4 P g ) 的荧光强度一致， 则样品中黄曲霉毒素B 含量即为5 P g / k g e如样液中荧光强度比最低检出量强， 则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不同的微升数， 直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下: 第一点: 1 0 P L O . 0 4 P g / m L 黄曲霉毒素B ， 标准使用液; 第二点 根据情况滴加1 0 P L 样液; 第三点: 根据情况滴加1 5 P L 样液; 第四点: 根据情况滴加2 0 P L 样液。 5 . 5 .式中:6 计算和结果的表示一 。 . 。 。 。 。 义 V , X D X 1 0 0 0X - V , rn(4)X ， 一 一 样品中黄曲霉毒素B ， 的含量, P g / k g ;V 。 一 一加入苯一 乙睛混合液的体积, m L ;叭一 一 出现最低荧光时滴加样液的体积， . L ;D- - 一样液的总稀释倍数;叭一 一 加苯 一 乙腊混合液溶解时相当样品的质量, g ;0 . 0 0 0 4一黄曲霉毒素B的最低检出量, P g5 . 6 双向展开法测定 1 0 2免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B 8 3 8 1一 8 7 如用单向展开法展开后， 薄层色谱由于杂质干扰掩盖了黄曲霉毒素s ， 的荧光强度， 需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚( 3 . 6 ) 作横向展开， 将干扰的杂质展至样液点的一边而黄曲霉毒素s ， 不动，然后再用丙酮一 三氯甲烷 ( 8 = 9 2 ) 作纵向展开， 样品在黄曲霉毒素B 、 相应处的杂质底色大量减少。因而提高了方法灵敏度， 如用双向展开法中滴加两点法， 展开仍有杂质干扰时则可改用滴加一点法 5 . 6 . 1 滴加两点法 5 . 61 . 1 点样: 取薄层板三块， 在距下端 3 c m基线上滴加黄曲霉毒素B ， 标准溶液与样液。即在三块板的距左边缘 0 . 8 -1 c m处各滴加 1 0 u L O . 0 4 p g / m L黄曲霉毒素B . 标准使用液， 在距左边缘2 . 8 - 3 c m处各滴加 1 6 p L 样液， 然后在第二块板的样液点上加滴 1 0 P L O . 0 4 p g / m L黄曲霉毒素B ， 标准使用液。在第三块板的样液点上加滴 1 0 p L O . 2 g g / m L黄曲霉毒素B 、 标准使用液。 5 . 6 . 1 . 2 展开 a . 横向展开: 在展开槽内的长边置一玻璃支架， 加入1 0 m L无水乙醚。将上述点好的薄层板靠标准点的长边置于展开槽内展开， 展至板端后， 取出挥干， 或根据情况需要时可再重复展开 t -2 次。 b . 纵向展开: 挥干的薄层板以丙酮: 三氯甲烷 ( 8: 9 2 ) 展开至 1 0 - 1 2 e m为止。丙酮与三氯甲烷的比例根据不同条件自行调节。 5 . 6 门. 3 观察及评定结果 在紫外灯下观察第一、 二板。若第二板的第二点在黄曲霉毒素s ， 标准点的相应处出现最低检出量， 而第一板在与第二板的相同位置上未出 现荧光点， 则样品中 黄曲霉毒素a ， 含量的5 p g / k g 以一 若第一板在与第二板的相同位置上出现荧光点， 则将第二块板与第三块板比较， 看第三块板上第二点与第 一 板上第二点的相同位置上的荧光点是否与黄曲霉毒素s 、 标准点重叠， 如果重叠， 再进行确证试验在具体测定中， 第一、 二、 三板可以同时作， 也可按照顺序作。如果按顺序作， 当在第一 板出现阴性时， 第三板可以省略。如第一板为阳性， 则第二板可以省略， 直接作第三板 5 . 6 . 1 . 4 确证试验: 另取两块薄层板。于第四、 第五两板距边缘0 . 8 1 c m处各滴加1 0 P L O . 0 4 p g /m L 黄曲霉毒素B 、 标准使用液及I 小滴三氟乙 酸( 3 . 1 2 ) ; 距左边缘2 . 8 - 3 c m处， 第四板滴加1 6 P L 样液及 小滴三氟乙酸。第五板滴加 1 6 p L 样液。 1 0 A L O . 0 4 P g / m L黄曲霉毒素B . 标准使用液及 1 小滴三氟乙酸， 产生衍生物的步骤同单向展开法， 再用双向展开法展开后， 观察样液是否产生与黄曲霉毒素B L 标准点重叠的衍生物。观察时， 可将第一板作为样液的衍生物空白板 如样液黄曲霉毒素B ， 含量高时， 则将样液稀释后， 按5 . 5 . 4 作确证试验。 5 . 6 . 1 . 5 稀释定量: 如样液黄曲霉毒素B 、 含量高时， 按5 . 5 . 5 稀释定量操作， 如黄曲霉毒素B ， 含量低稀释倍数小， 在定量的纵向展开板上仍有杂质干扰， 影响结果的判断， 可将样液作双向展开测定， 以确定含量 5 . 6 . 1 . 6 计算: 同5 . 5 . 6 , 5 . 6 ， 2 滴加一点法 5 . 6 . 2 . 1 点样: 取薄层板三块， 在距下端 3 c m基线上滴加黄曲霉毒素B ， 标准使用液与样液。即在三块板距左边缘。 . 8 - 1 c m处各滴加1 6 匹样液， 在第二板的点上加滴 1 0 p L O . 0 4 p g / m L 黄曲霉毒素B , 标准使用液， 在第三板的点上