比较南瓜,西葫芦的糖,蛋白质含量测定和探讨.docx

西葫芦、南瓜中可溶性蛋白质和糖含量的测定和探讨摘要：采用考马斯亮蓝G-250染色法测定西葫芦、南瓜中蛋白质的含量分别是：2.201mg/g,11.077mg/g采用蒽酮法测定南瓜、西葫芦中可溶性糖的含量分别是：49.44mg/g,112.37mg/g实验表明南瓜中含有的糖分,蛋白质均较西葫芦丰富，而它们中各自糖含量多于蛋白质。关键词：；西葫芦；南瓜；蛋白质；糖；含量引言 ： 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量测定 一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、材料、主要仪器和试剂1实验材料新鲜绿豆芽2主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000gmL 的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。（3）乙醇（4）磷酸（85）四、操作步骤1标准曲线制作（1）0100gmL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1 低浓度标准曲线制作（2）01 000gmL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为01 000gmL 的标准曲线。表2 高浓度标准曲线制作2样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.51h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL 容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（g）。以标准曲线1 号试管做空白。五、结果计算式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（g）。六、附 注1Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。3蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。七、思考题1制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？ 植物组织中可溶性糖含量测定 植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。（一）苯酚法测定可溶性糖【实验原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。【实验仪器及试剂】1仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。2试剂：（1）90苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。（2）9苯酚溶液：取3mL 90苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。（3）浓硫酸（比重1.84）。（4）1蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。【实验步骤】1标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从010分别编号，按表271加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 520s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。2可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.100.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。式中：C一标准方程求得糖量（ug）一吸取样品液体积（mL）V提取液量（mL）n一稀释倍数W一组织重量（g）（二） 蒽酮法测定可溶性糖【实验原理】糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。【实验仪器及试剂】1仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20ml刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。2试剂：（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数周，如有结晶析出，可微热溶解。（2）浓硫酸（比重1.84）【实验步骤】1标准曲线的制作：按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。2可溶性糖的提取同方法一第二步。3显色测定：吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。4计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一1 材料和方法 1.1 材料和试剂 实验材料为西葫芦、南瓜样品。标准蛋白质溶液:由25mg牛血清蛋白加水稀释而成。考马斯亮蓝试剂:100mg考马斯亮蓝，95%乙醇，85%磷酸加蒸馏水混合而成。标准葡萄糖溶液：由100mg葡萄糖加水稀释而成。蒽酮试剂：1g蒽酮，乙酸乙酯混合而成。1.2 方法a.蛋白质标准曲线的绘制取6支试管，按下表加入试剂后，在向各管中加入5ml考马斯亮蓝试剂，5min后，以0管为空白对照，在595nm下比色测定吸光值。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。试 剂管 号012345标准蛋白质（ml）00.200.400.600.801.00蒸馏水量(ml)1.000.800.600.400.200蛋白质含量（ug）020406080100b.蛋白质样品的测定分别取西葫芦、南瓜各0.5g，用5ml蒸馏水研磨成浆后，3000r/min离心10min,测上清液总体积。吸取样品提取液1.0ml稀释，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置两分钟后在595nm下比色，测吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。1.3.糖类样品的测定a.糖类标准曲线的绘制取6支具塞试管，按下表加入试剂后，在向各管中加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢加入5ml浓硫酸，在沸水浴中煮沸10min后冷却。在620nm下比色测定吸光值。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。管号123456标准葡萄糖原液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.0葡萄糖含量（ug）04080120160200 b.糖类样品的测定 分别取西葫芦、南瓜各1g，置于研钵中，用5ml蒸馏水研磨成浆，然后转入20ml试管中，用5ml蒸馏水充分洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10min，冷却后在4000r/min下离心10min，滤液收集到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。用移液管吸取1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂，再缓慢加入5ml浓硫酸，盖上试管塞后摇匀，再置沸水浴中10min，冷却至室温，在波长620nm下比色，测定吸光值。并通过标准曲线得知相应的葡萄糖含量。2观测结果2.1蛋白质和糖类标准曲线：各管中标准蛋白质的吸光值见表1表1 各试管中标准蛋白质的吸光值管号012345蛋白质含量（ug）020406080100吸光度0-0.0120.0050.0120.0180.030各管中标准葡萄糖的吸光值见表2表2 各试管中标准葡萄糖的吸光值管号123456葡萄糖含量（ug）04080120160200吸光度00.1050.2620.3880.4760.653蛋白质标准曲线的绘制：y=0.000485x-0.0185 多糖标准曲线的绘制：y=0.003275x-0.01622.2西葫芦、菜花中蛋白质和糖吸光度：样品西葫芦南瓜蛋白质吸光度0.0960.646糖类吸光度1.3092.436蛋白质提取液总体积VT(ml)4.33.8糖样品鲜重（g）1.00991.0095蛋白质样品鲜种（g）0.460.5糖提取液总体积VT（ml）8.16.6 2.3计算结果 （1）样品中蛋白质的含量=C*VT（VS*WF*1000）C查标准曲线值， ugVT提取液总体积， mlVF测样时加样量，mlWS样品鲜重，g蛋白质含量(ug)提取液总体积ml测样时加样量，ml样品鲜重，g西葫芦236.084.31.00.46南瓜1370.103.81.00.47将西葫芦蛋白质吸光值代入y=0.000485x-0.0185,得x=236.08所以西葫芦中蛋白质的含量=2.201（mg/g）将南瓜蛋白质吸光值代入y=0.000485x-0.0185，得x=1370.10所以南瓜中蛋白质的含量=11.077（mg/g）（2）样品含糖量=样品含量（ug）*稀释倍数*100/样品重（g）*106g/100g鲜种糖含量 糖样品鲜重（g）糖提取液总体积（ml）稀释后总体积(ml)稀释倍数西葫芦404.6411.00998.110012.34南瓜748.7631.00956.610015.15将西葫芦糖类吸光度代入y=0.003275x-0.0162，得x=404.641所以西葫芦中糖含量=4.944（g/100g鲜重）=49.44mg/g将南瓜糖类吸光度代入y=0.003275x-0.0162，得x=748.763所以南瓜中糖含量=11.237（g/100g鲜重）=112.370mg/g3讨论 3.1不同种植物体内糖含量的比较