SDS-PAGE测定蛋白质分子量.docx

SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。2、掌握垂直板电泳的操作方法。3、运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。l二、实验原理1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。2、PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个:1)溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:32)样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L3)二硫键是否完全被还原采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全打开二硫键，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的Mr。已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。一般至少采用两种方法测定未知样品的分子量，互相验证。4、PAGE电泳中各种成分及其作用： 过硫酸铵：凝胶聚合的催化剂（过量会使离子强度升高。），四甲基乙二胺：加速剂。（碱性条件下容易聚合）丙烯酰胺与双丙烯酰胺：二者总浓度及相对比例决定凝胶的孔径、交联度，硬度及弹性。浓缩胶与分离胶浓缩胶：胶浓度低，交联度低，pH=6.7，蛋白带负电荷少，大孔胶。 pH=6.7时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较少（慢离子），氯离子是快离子，蛋白迁移速率介于两者中间，局部电位梯度大，（快离子移动快，形成局部低电导区，产生高电位，使移动加快）从而产生浓缩效应。分离胶：胶浓度高，交联度高， pH=8，蛋白带负电荷多，小孔胶， pH=8.0时，电极缓冲液中甘氨酸负离子解离较多，与氯离子一样，迁移速度加快，蛋白迁移速率最慢，部电位梯度小。三、实验试剂和器材1、材料：低分子量标准蛋白试剂盒，蛋白质样品。 2、试剂： 30%丙烯酰胺，10%SDS（十二烷基磺酸钠），1.5mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液，0.5mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液，10%过硫酸铵(AP)，TEMED（四甲基乙二胺），样品缓冲液液，固定液，染色液，脱色液，SDS 电极缓冲液，琼脂糖。 3、器材： 垂直板电泳装置，直流稳压电源，移液管，滤纸，微量注射器，大培养皿。 4、部分凝胶制备 分离胶：12.5%，分离胶缓冲液3ml，丙烯酰胺贮备液5ml，10%过硫酸胺120ul，水4ml，TEMED12ul，混匀后灌胶，水封。 浓缩胶：5%，浓缩胶缓冲液3ml，丙烯酰胺贮备液1ml，10%过硫酸胺60ul， 水2ml，TEMED6ul。混匀，待分离胶凝固后，到去水，灌胶。四、实验步骤 1、垂直电泳装置的装配：将玻璃板洗净晾干，在玻璃条两侧均匀涂抹凡士林 后，夹在两玻璃板之间两侧，固定在灌胶支架上。2、灌胶：用琼脂凝胶将玻璃下端封好后，按比例配好的分离胶迅速加入玻璃板之间，高度约玻璃板的2/3，加入少许水，静置40min，待凝固后，倒出水，并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好的浓缩胶，连续平稳的加入浓缩胶至边缘5nm处，迅速插入样梳，静置40min，凝固后，在上槽内加入缓冲液后，拔出样梳。 3、加样：取10ul标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10ul 2倍样品缓冲液，上样量为10ul。同样处理样品，用微量注射器距离槽底1/3处进样，加样前，样品在沸水浴中加热30min，去掉亚稳态聚合。 4、电泳：电泳槽内加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距离凝胶边缘5mm时，停止电泳。 5、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开剥离板，待凝胶板做好标记后放在大培养皿中，加入染色液，染色1h左右。 6、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色染液脱色，直至蛋白质区带清晰。五、实验结果及分析1)实验数据记录标准蛋白蛋白质分子迁移距离（厘米）相对迁移率蛋白质分子质量的对数值A0.80.1434.99B1.60.2864.82C1.90.3394.63D2.90.5184.99E4.30.7684.30F4.70.8394.16样品12.60.46423.00.53633.40.607染料的迁移距离=5.6厘米2）绘制标准曲线相对迁移率=蛋白质分子迁移距离/染料迁移距离以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移距率作图的得到标准曲线。量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量。这样的标准曲线只对同一块凝胶上样品的分子量测定才具有可靠性。此标准曲线：lgMr=-1.233*相对迁移率+5.166样品1的相对迁移率为0.464，由标准曲线得到其相对分子质量的值为 4.594 ，则其分子量应为 39264 。 样品2的相对迁移率为0.536，由标准曲线得到其相对分子质量的值为4.505 ，则其分子量为 31989 。 样品3的相对迁移率为0.607，由标准曲线得到其相对分子质量的值为 4.418 ，则其分子量应为 26182 。可能由于上样量少的原因,标准蛋白质分子那几条带不是很明显,导致结果存在偏差. 六、思考题1、在不连续体系SDS-PAGE中，当分离胶加完后,需在其上加一层水，为什么？答：加一层水的作用有下：1）隔绝空气，防止分离胶中挤入空气。2）降低温度，加速分离胶的凝固。3）使分离胶上表面平整，即分离胶与浓缩胶相接面平衡，蛋白质分离效果好。2、样品溶解液中各种试剂的作用是什么? 答：1）SDS的作用：SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。 2）巯基乙醇的作用：巯基乙醇是一种强还原剂，能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，这样蛋白质被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上。 3）溴酚蓝的作用：使蛋白质样品呈现蓝色，电泳时，可通过溴酚蓝的迁移距离