血栓与止血检验的基本方法.ppt

血栓与止血检验基本方法,P367,血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层 内层：内皮细胞+基底膜 内皮细胞管壁有肝素类物质 内皮细胞内含细胞器 （棒状小体 vWF和t-PA，TM，AT-,PAI-1等 ） 中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层） 外层：结缔组织,基本理论,第一节、血管壁（内皮）检验,血管内皮细胞检验,血浆血管性血友病因子抗原vWF:Ag，LPEITA法,原理：在待测血浆中加入包被有抗vWF:Ag单克隆抗体的胶乳颗粒，血浆中vWF:Ag与胶乳颗粒结合，使相邻的胶乳颗粒彼此相连，发生凝集反应，其凝集强度直接与血浆中的vWF:Ag含量成比例关系，通过血凝分析仪可快速测得。,参考值 41.1%125.9%（O型）； 61.3%157.8% （A+B+AB型） O型人群明显低于A+B+AB型人群,vWF:Ag 参考区间,血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断 1.减低 见于血管性血友病（vWD），是诊断vWD及其分型的重要依据 2.升高 见于血栓性疾病，如急性冠脉综合征（ASC）、心肌梗死、脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。 应用评价以前vWF：Ag定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现在少用。ELISA常用于定量检测vWF：Ag，但是胶乳增强的免疫比浊法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。,vWF:Ag 应用评价,原理将抗人凝血酶调节蛋白（Thrombomdulin,TM）单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的TM结合于包被的放免小杯上，加入125I-抗人TM单抗，根据结合的125I放射性强度计算出样品中TM的含量。,血浆血栓调节蛋白，TM 放射免疫法,TM:Ag的水平升高 见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血栓、深静脉血栓形成（ DVT）、DIC等。 降低见于TM缺乏。,TM ：Ag参考区间 2035ng/mL,第二节 血小板止血作用及检验,血小板（blood platelet）由骨髓中成熟巨核细胞的胞 质分割生成，是哺乳动物血液中体积最小的血细胞。 血小板数量：(100300) x109个/L（成年人）。 血小板寿命：710天。 主要功能：促进止血和加速凝血，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中起重要作用。,血小板的主要释放产物,血小板功能的实验室检查,应用评价 本试验是检测血小板功能的基本试验之一，试验简便、快速，成本低廉，在临床上开展比较广泛。 血小板聚集率减低：见于血小板无力症、血小板贮存池病、血管性血友病、巨大血小板综合征、低（无）纤维蛋白原血症、肝硬化、尿毒症、维生素B12缺乏症、细菌性心内膜炎、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、特发性血小板减少性紫癜、服用抗血小板药物等。 血小板聚集率增高血液高凝状态和（或）血栓形成性疾病，如动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、深静脉血栓形成、高脂饮食、口服避孕药和吸烟等。,血小板聚集实验 PAgT 光学比浊法和全血电阻抗法,血小板膜糖蛋白（Glucoprotein，GP）是血小板功能和血小板与其他活性物质作用的基础，一些糖蛋白如GP Ia、GP Ib、GP IIb、GP IIIa等已被确定为血小板特异抗原。 GP 分子数量或结构异常均可导致出血或血栓形成。 活化血小板与静止血小板相比，GP 的种类、结构、含量等亦呈现显著变化。 多采用流式细胞术（FCM）分析血小板膜糖蛋白的表达。,血小板膜糖蛋白测定,血小板自身抗体包括： 血小板相关免疫球蛋白（platelet associated immunoglobulin， PAIg）（包括PAIgG、PAIgA、PAIgM）特异性膜糖蛋白自身抗体 药物相关自身抗体 抗同种血小板抗体 血小板自身抗体测定表达有助于判断血小板减少的原因。检测血小板免疫相关球蛋白的常用方法为ELISA及流式细胞术。,血小板自身抗体测定,特发性血小板减少性紫癜（ITP）： 90%以上的病人PAIgG增加，同时测定PAIgA、PAIgM及PAC3阳性率达100%。 ITP病人在皮质激素治疗后，PAIgG不下降可作为切脾的指征。 ITP疗效监测指标，治疗有效上述指标下降，复发则增加。,血小板相关抗体测定的应用评价,第三节 血液凝固及检验,14个：12个经典凝血因子 激肽释放酶原+高分子量激肽原 特征：因子为钙离子（Ca2+）,其余均为蛋白质 除因子即组织因子外，其余均存在于新鲜血浆中 依赖维生素K的凝血因子 ：因子、和 接触凝血因子 ：因子、激肽释放酶原及高分子量激肽原。 对凝血酶敏感的凝血因子 ：因子、V、,血液检验,二期止血缺陷的筛选试验 主要涉及凝血因子和抗凝血物质的异常，用于凝血与抗凝血功能筛查的试验较多，常用的有：凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、试管法凝血时间（clotting time，CT）。,(一)血浆凝血酶原时间测定（PT） 1.原理 在受检血浆中加入足量组织凝血活酶（即TF）浸出液和和适量Ca2+离子后，血浆凝固所需的时间称为血浆PT。,血液检验,2.参考值 (1)平均为12s1s,男性：11s13.7s； 女性：11s14.3s，超过对照3s以下为异 常。 (2)PT时间比值（PTR）=被检血浆PT（s） /正 常参比血浆PT（s），宜用多份正常血浆PT 的几何均数参考值为1.000.15 (3)国际标准化比值(INR)=PTRS 参考值因国际敏感度指数S而异。,血液检验,INR：需先求得所用组织凝血活酶的国际敏感度指数S，是所用组织凝血活酶与已知参比品相比较的一个参数。是用多份凝血因子水平不同的血浆（包括正常人和口服抗凝剂患者的血浆），用参比品测得它们的logPT，再用待标定的组织凝血活酶测得它们的logPT，以前者为纵坐标，后者为横坐标作图，经回归求得直线斜率。即待标定的组织凝血活酶的S =已知S 斜率。S值越低，试剂对有关凝血因子降低的敏感度越高。再按下式求得INR： INR=PTRS,血液检验,3.临床意义：是外源性凝血途径的筛选试验。 (1)PT延长 Vitk缺乏：、统称为依赖Vitk凝 血因子。Vitk、因子 PT。 抗凝治疗，香豆素类抗凝药物与Vitk化学结 构相似，竞争性拮抗，使PT。 肝病：肝脏是合成除组织因子（）、钙（） 及因子外其他因子的主要场所，肝受损凝 血因子合成PT。 先天性凝血因子缺乏症：、。 抗凝物质增多。 (2)PT缩短：常见于血栓前状态和血栓性疾病。,血液检验,(二)活化部分凝血活酶时间测定 1. 原理：37条件下，以白陶土激活因子和 ，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板3 因子，在Ca2+参与下，观察血浆凝固所需的时间，即为活化部分凝血活酶时间 （APTT）。,血液检验,2.参考值 男：37s3.3s 女：37.5s2.8s 超过正常对照10s以上为异常。,血液检验,3. 临床意义：是内源性凝血系统敏感而简便的筛 选试验。 (1)APTT时间延长： 内源性凝血途径因子缺乏：、。 外源性凝血途径因子缺乏：、。 血中抗凝物质增多。 (2)APTT时间缩短：可见于高凝状态及血栓形成 性疾病。,血液检验,(三)凝血酶时间测定 1.原理：受检血浆中加入“标准化”的凝血酶溶液后、血浆凝固所需要的时间，即为凝血酶时间。 2.参考值：16s18s。超过对照3s以上为异常。,血液检验,3.临床意义 (1)TT延长： 肝素及肝素类抗凝物增多。 FgDP(FbDP)DIC(消耗Fb 或Fg)。 先天性纤维蛋白(原)异常或缺乏症。 (2)TT缩短:极罕见,主要见于某些异常蛋 白血症如巨球蛋白血症。,血液检验,三、纤溶活性的筛查试验 血浆纤溶活性增强的筛查，一般选用能直接或间接检测出血浆纤溶酶降解纤维蛋白（原）降解产物（FDPs）的试验，临床常用的有：凝血酶时间（thrombin time，TT）、血浆鱼精蛋白副凝固试验（plasma protamine pracoagulation test，3P test）。,血液检验,(一)可溶性纤维蛋白单体试验：3P试验 1原理：血浆硫酸鱼精蛋白副凝固试验（plasma protamine paracoagulation test,3P test），是在待测血浆中加入硫酸鱼精蛋白,可使可溶性纤维蛋白单体(FM)与FDP(主要是X片段)形成可溶性复合物解离,游离的FM之间自行聚合呈肉眼可见的纤维絮状或胶冻状沉淀。,血液检验,2.参考值：阴性 3.临床意义 (1)原发性纤溶时：阴性。 (2)继发性纤溶时早期：阳性。 (3)DIC的晚期因FgDP或FbDP（X、Y）被降解为低分子量小碎片（D、E）：阴性。,血液检验,(二)血浆D-二聚体检测 乳胶颗粒浊度分析法 1.原理：受检血浆中加入标有D-二聚体单抗的胶乳 颗粒悬液，如果血浆中D-二聚体含高于0.5mg/L 时即可与胶乳颗粒上的抗体结合，发生胶乳颗 粒凝集。,血液检验,2血浆D-二聚体 是交联纤维蛋白降解产物之一，为继发纤溶特有的代谢物。,血液检验,纤维蛋白（原）降解过程及产物 凝血酶 XIIIa 纤维蛋白（原） 可溶性纤维蛋白 交联纤维蛋白 FPA、FPB （A1-6 ） (B1-14) B1-42 B15-42 A极附属物多聚体 A极附属物 A极附属物 D-二聚体 （A、B、C、H） （A、B、C、H） DD/E复合物 X、Y、D、E X、Y、D、E X、Y、D、E,纤溶酶,纤溶酶,纤溶酶,3意义 参考值阴性，在继发纤溶时（DIC）阳性；原发纤溶时阴性。常作为鉴别原发性纤溶与继发性纤溶的可靠指标，也是溶栓治疗的有效观察指标。D-二聚体阳性或增高是诊断DIC的重要依据之一。,凝血因子的检测 一、血浆纤维蛋白原 1. 原理:Clauss法以凝血酶作用受检血浆中 纤维蛋白原(Fg)，使其形成纤维蛋白而使 血浆凝固,测定凝固时间。纤维蛋白的量 与凝固时间成负相关，检测结果与参比血 浆制成的标准曲线对比，可得出纤维蛋白 原的含量。 2.正常参考值：24g/L。,血液检验,3.临床意义 (1) 增高 机体感染；毒血症、肝炎、轻型肝炎、胆囊炎及 长期局部炎症 无菌性炎症：糖尿病、肾病综合症、尿毒症、风 湿热、恶性肿瘤、风湿性关节炎等。 糖尿病酸中毒。 心血管疾病：动脉硬化症、脑血栓、血栓静脉炎、心肌梗塞、放射治疗。 妇女经期、妊趁晚期、妊高症及剧烈运动后。 放疗后，灼伤，休克，外科大手术后，恶性肿瘤 等。,血液检验,(2)减低 肝脏疾病：慢性肝炎、肝硬化、急性肝萎缩。 砷、氯仿、四氯化碳中毒均可使纤维蛋白原减 少。 DIC：因纤维蛋白原消耗及继发性纤溶活性亢进 纤维蛋白原呈进行性下降。 原发性纤维蛋白原缺乏症。 原发性纤溶活性亢进。 恶性贫血及肺、甲状腺、子宫、前列腺手术。 天门冬酰胺酶治疗白血病。 监控：溶栓治疗的监控范围：1.2g/L1.5g/L， 低于1.2g/L时引起病人出血。,血液检验,二、F、F、F、F凝血活性测定 1.原理：将病人血浆与缺乏因子 ：C ； ： C ；：C ；：C基质血浆混合， 作APTT，计算病人血浆中所含因子含量占 正常人的百分率。 2.优点：方法简便，可分型。 3.缺点：缺乏因子：C等基质血浆，来源 困难。,血液检验,2.要求 (1)吸附血浆：含、。（注意： 有、无） (2)血清：含、。（注意：有、 无） 3.临床意义 (1)PT正常，可确定是否有：、 、 PF3缺乏或抗凝物质存在。 (2)/缺乏的结果：PT延长，推测可能有 缺乏。 (3)/缺乏的结果：PT延长，推测可能有 缺乏。,血液检验,第十四章 血栓与止血检验的临床应用 第一节 出血性疾病中的应用 一、血栓与止血筛选检验的应用,血液检验,（一）一期止血缺陷筛检试验 一期止血缺陷：是指血管壁和血小板异 常所引起的止血功能缺陷。如临床出现不同 程度的出血时，筛检试验可分为以下四种情 况：,血液检验,出血时间延长合并血小板计数 减少 正常 增多 血小板增多 血小板减少 某些凝血因子缺乏 血小板功能缺陷 血管性血友病 低(无)纤维蛋白原血症,原发性/继发性 血小板减少症,遗传性 / 获得性 血小板功能缺陷,遗传性/获得性 vWF缺陷,遗传性/获得性 低(无)纤维蛋白原血症,原发性/继发性 血小板增多,血液检验,（二）二期止血缺陷筛检试验 二期止血缺陷：是指血液凝固和纤溶 异常所引起的止血功能缺陷。若临床出现不同程度的出血时，筛检试验分为以下四种情况：,血液检验,APTT(N) APTT(N) APTT(A) APTT(A) PT(A) PT(N) PT(N) PT(A) 外源途径 因子定性 内源凝血途径缺陷 共同途径缺陷 缺陷 试验阳性 有出血 无出血,因子 缺陷症 (遗传性 /获得性),因子 缺陷症 (遗传性 /获得性),因子、PK HMWK、 缺陷症 (遗传 性/获得性),因子、 缺陷症 (遗传性 /获得性),因子、 、Fg缺陷症 或存在血液凝 固调节异常,同时检测APTT和PT对二期止血缺陷的应用,血液检验,二、 过敏性紫癜 (P315) （一）概念：本病是一种变态反应性疾病，主要是由于机体对某些致敏物质（过敏原）发生变态反应而引起全身性毛细血管壁的通透性和（或）脆性增加，导致以皮肤和粘膜出血为主要表现的临床综合征。好发于儿童和青年人，并且在20岁以前发 病率约占80%以上。,血液检验,（二）主要过敏原： 1.感染：细菌、病毒、和寄生虫等； 2.食物：鱼、虾、蟹、蛋、奶等； 3.药物：某些抗生素、镇痛解热药和抗结核 药等； 4.其他：花粉、昆虫叮咬、预防接种和寒冷 气候等。,血液检验,（三）发病机机制：是过敏原通过以下两种变态 反应引起血管病变。 1.速发型变态反应：由肥大细胞所释放的组织 胺等生物活性物质使毛细血管扩张或通透性 增加。 2.抗原抗体复合物：主要是IgA的复合物沉积在 毛细血管壁上从而激活补体引起血管炎症性 反应。,血液检验,（四）临床表现：本病发病前常有上呼吸道感染的 前驱症状或有相关的过敏原接触史。其典型表 现分为以下五型。 1.单纯紫癜型：好发于下肢、关节周围和臀部，紫 癜常呈对称分布，大小不等、呈暗红色。 2.关节型：多见于膝、肘、踝、碗等大关节，呈游 走性红、肿、热、痛。 3.腹型：呈阵发性腹绞痛或持续性钝痛，有压痛但 无肌紧张，可伴恶心、呕吐、腹泻、血便等。 4.肾型：呈不同程度蛋白尿、血尿、管型尿等。 5.混合型：有上述两型或两型以上表现者。,血液检验,（五）实验室检查： 1.血象：白细胞数、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞 可增高，血小板计数正常。 2.骨髓象：大致正常，部分病例可有嗜酸性粒细 胞比值增高。 3.凝血功能检测：血小板功能试验、凝血和纤溶 试验均正常。 4.尿液检测：部分病人（约占25%50%）肾功能 异常。 5.其他：ESR增快、血清IgA增高。,血液检验,三、 特发性血小板减少性紫癜 （一）概念 特发性血小板减少性紫癜（idiophathic thrombocytopenic purpura， ITP）是一种免疫性血小板破坏过多所致的血小板减少性疾病。 儿童、急性；成人、慢性；女男。,血液检验,（二）病因及发病机理 1免疫因素：病人血清中抗血小板抗体，与血小板 GPb/a结合单核-巨噬系统清除。 2脾脏：（1）血小板抗体产生部位；（2）结合抗 体 的血小板破坏部位。 3血小板无效生成：巨核、血小板共同抗原性，抗 体巨核成熟障碍，原位破坏。,血液检验,（三）临床表现，发病前有病毒感染史，起病急， 皮肤大片紫癜、瘀斑，鼻腔、口腔粘膜出 血。也可内脏出血，自限性。 1急性型：37岁婴幼儿，紫癜出现前1 3周常 有上呼吸道感染史，起病急骤，常伴发热、皮 肤紫癜、粘膜和内脏出血。 2慢性型：青壮年，女男，反复发作皮肤紫癜、 口腔刷牙出血，月经量过多，内脏出血少。反 复发作可轻度脾大，贫血。,血液检验,（四）实验室检查 1血象：血小板减少（急性20109/L、慢性 3080109/L），伴有体积增大、畸型、可伴 小低贫。 2骨髓象：巨核细胞代偿性增生，急性：幼巨、 颗粒巨、产板巨；慢性：颗粒、产板。 3. PAIg和PAC3测定：PAIg和/或PAC3。 4血小板寿命测定：寿命缩短。 5血小板功能检查：功能异常。,血液检验,（五）诊断标准 1血小板减少，伴或不伴贫血。 2巨核细胞增高或正常，伴成熟障碍。 3无明显脾大。 4无结缔组织病及其他继发性血小板减少症。 5符合下列三项之一 （1）皮质激素或切脾有效。 （2）PAIg和PAC3增高。 （3）血小板寿命缩短。,血液检验,（六）鉴别诊断 1Evan综合征：ITP伴自免溶贫，Coombs试验 阳性。 2血栓性血小板减少紫癜（TTP）：微血管病 性贫血，PLT减少。特征有：发热、出血、 溶血、神经症状及肾脏损害。 3脾亢：血象三系减少、骨髓粒红二系成熟 障碍、明显脾大。 4AA：血象三系减少，骨髓巨核细胞减少或 缺如，非造血细胞增多。,血液检验,四、血友病与血管性血友病 血友病和血管性血友病是临床常见的由于凝血因子遗传性缺陷所引起的出血性性疾病。,血液检验,（一）血友病 1.概念 血友病（hemophillia）是一组由于遗传性凝血因子或基因缺陷导致的激活凝血酶原酶的功能发生障碍所引起的出血性疾病。血友病：分甲、乙两型，甲型缺乏、乙型缺乏。,血液检验,2.病因及发病机理 血友病属于性连锁隐性遗传：C、：C 基因定位于 X染色体上(Xq28和Xq27)。 (1)男性患者：所生的女儿都为基因缺陷携带者， 所生的儿子都为正常。 (2)女性携带者：所生的女儿50%的是正常人， 50% 是携带者；所生的儿子50%是患者，50%是正常 人。 (3)女性携带者和男性患者结婚：所生女儿50%为 携带者，50%为患者；所生的儿子50%为患者， 50%的为正常人。 (4)男、女均为患者结婚：所生子女均为患者。,血液检验,3.临床表现 (1)肌肉出血：常发生于负重肌群，有红、 肿、热、痛等表现。 (2)关节腔出血：常发生于负重大关节腔， 严重者畸形、活动受限。 (3)部分有皮肤粘膜出血。 (4)内脏出血或手术后渗血不止。,血液检验,4.实验室检查 (1)筛选试验：ACT（活化凝血时间）和APTT。 (2)纠正试验：STGT（简易凝血活酶生成试验）及 纠正试验延长15秒以上。 (3)确诊试验：Bijjs凝血活酶生成试验 正常吸附血浆纠正：血友病甲。 正常血清纠正：血友病乙。 正常吸附血浆、血清均纠正：缺乏。 正常吸附血浆、血清均不纠正：抗凝物质增多。 (4)因子活性测定 ：C、：CAg正常 结构异常。 ：C、：CAg 合成血友病。,血液检验,(二)血管性血友病（vWD） vWD是由于构成因子复合物中血管性血友病因子（vWF）基因的合成及表达缺陷导致vWF质和/或量的异常所引起的出血性疾病（是仅次于血友病A的另一种常见出血性疾病）。 型：vWF合成、vWF多聚体结构正常。 型：vWF结构和功能缺陷。 型：vWF：Ag或缺如。,血液检验,1.病因 、型：为常染色体显性遗传。 型：为常染色体隐性遗传,血液检验,2.临床表现 (1)皮肤紫癜和瘀斑。 (2)粘膜（鼻衄和龈血）出血及月经量增 多。 (3)创伤、手术和分娩常有异常出血。 (4)一般无关节腔和肌群出血。,血液检验,3.实验室检查 (1)：C：/N。 (2)vWF：Ag或缺乏。 (3)vWF瑞斯托霉素辅因子：、型，型 /N。,血液检验,五、弥散性血管内凝血 (一)概述 弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)是由于多种病因所引起的血栓与止血病理生理改变的一个中间环节。其特点是体内有血小板聚集，病理性凝血酶生成，纤维蛋白在微血管中沉积，形成广泛性微血栓。在此过程中，消耗了大量血小板和凝血因子，使凝血活性降低。同时，通过内源性激活途径引发继发性纤溶亢进。最终导致微血栓病性凝血障碍和出血症状。,血液检验,（二）病因及发病机理 内毒素、抗原抗体复 纤原 纤维蛋白 合物、缺氧、酸中毒 血管内皮损伤 内源 感染、休克等 PLT粘附、聚集 病理、产科、组织损伤 、活性、促凝 输血反应、溶血红细 外源 激活 可溶性 胞、血小板破坏PF3 不溶性,血液检验,凝 血 酶,血 栓,大量凝血因子、PLT、a、 激肽释放酶 可溶性纤溶系统出血 受损组织、血管内皮t-P