血液促凝剂质量控制及质量体系的建立.ppt

血液促凝剂质量控制方法 及质量控制体系的建立,撰稿及主讲人： 白 原西安第四军医大学 唐都医院检验科,前 言,血液促凝剂是生产真空采血管促凝管的核心原料，使用量大，技术要求高。对所制成的分离胶-促凝管的技术性能影响甚为关键，其技术水平代表了企业在真空采血管产品领域的真实技术水平。国内采血管企业的技术竞争主要还是促凝剂的好与坏的竞争，使用了好的促凝剂，产品的竞争力就会显著提高。,血液促凝剂，国内大多采用普通硅石粉制成，促凝效率较低，一般凝血时间在15 分钟左右，凝固后还需放置20分钟左右时间才能上机离心，离心时间也比较长，一般需要8-10分钟，即使这样仍然含有干扰吸样的纤维蛋白。在计量的掌握方面要求严格，浓度过高易造成溶血。,目前，全国采血器的生产厂家所采用的促凝剂配方非常混乱，但是归纳总结起来无外乎生物型和无机型两种类型，或者两种类型混合。生物型的主要成分为凝血致活酶和兔脑粉。,凝血酶的缺点是具有所有酶的特征，不好保存，受诸多因素影响容易失活。尤其在冬季受温度影响很大，温度低则活性降低，凝血时间自然也就延长。 兔脑粉虽然凝血速度快，但是仍然受温度制约，凝血酶和兔脑粉的凝血原理由于是以血浆先凝固然后带动血球凝固的，血块凝集是通过纤维蛋白网罗血细胞而实现的。因此血块收缩不是十分理想，离心后血球仍然是以松散流动的形式存在的。,无机型的主要成分是：高岭土、石英粉、硅藻土、硅石粉、玻璃粉等。起作用的主要是所含成分二氧化硅 二氧化硅的含量在不同的产品中是不同的，因此，凝集活性自然也有差别。无机型的缺点是凝血速度慢，还有纤维蛋白会二次析出的弊病 。,二氧化硅的作用是激活机体的内、外凝血系统，启动瀑布式凝血反应。作用于血小板第、因子。但是，无机型的缺点是凝血时间较有机型的长，压纤维蛋白的功能较弱。完成这个过程需要一定的时间和温度，也不可能在短时间内完成凝血的全过程。各个厂家的配方也参差不齐，凝血效果则有好有坏。总而言之，包括国外的知名品牌在内，还未达到理想的状态。,用以下技术指标综合评价促凝剂的优劣：1、凝血时间长短。2、放置时间与上机离心的时间。3、有无明显的纤维蛋白（即影响吸样针吸样的程度）。4、管壁清洁程度。5、分离胶的清洁程度（分离胶内夹带血丝少，分离胶离心后应呈白色）。6、血清的清析度如何。7、受温度影响的大小。8、是否达到100%的一次离心成功率。9、有无完善的质量控制体系，特别是不须采用抽血验证的方法科学、客观、准确的评价促凝剂的优劣。,本产品的原理如下：配方主要成分之一PHA 凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。,植物血凝素是一种具有胶凝性特点的蛋白质，它与血液中的抗原会发生化学反应引起红血球的聚集。本促凝剂是个综合性的配方，PHA的提取工艺是关键技术，由于传统的提取技术比较复杂，并且主要用于制药工业，没有适合促凝剂方面的专用提取技术，通过我自创的独特提取工艺保证了产品的稳定性和持久性，达到了采血管工艺所需要的技术指标。,耐高温实验：将噴有促凝剂的试管放置在552的水浴箱内2小时，然后抽血实验验证是否对凝血效果有影响。并采用96孔国际标准血凝板和显微镜凝集法实验验证对血凝的影响。,低温实验：将噴有促凝剂的试管与对照管预先放在冰箱内30分钟预冷。然后抽血混匀后存放在2-4的冰箱内20分钟取出，3500转/分离心5分钟，验证凝血效果。并采用显微镜凝集法实验验证对血凝的影响。,纠正一个认识误区,现在，无论是医院还是采血管企业，对于促凝剂的评价都是追求凝血时间的快与慢，似乎凝血时间越快越好。实际上这是一个认识上的误区，必须要纠正，下面我从理论上来加以阐述： 众所周知，血液的凝固是需要13种凝血因子相继激活，以最后纤维蛋白元转化为纤维蛋白网罗血细胞而实现血液凝固的。完成这个过程是需要花费一定时间的，加入促凝剂仅仅是为血液凝固提供血液凝固所需要的材料，而不能提前加快凝血时间与速度。加入凝血酶或兔脑粉后血液能在短期内凝固是一种假象，实际是血浆凝固而带动血球凝固了，真正意义上的血液凝集的发生应该是血球发生充分的凝固才行。而完成这个过程需要花费6-10分钟的时间，在这个过程中，纤维蛋白被充分的消耗。,在工厂里，生产含促凝剂的采血管都要进行试管的前期硅化与烘干处理，喷完促凝剂以后还要烘干。浪费时间、工时、电力。为了解决以上这些问题，本促凝剂已经成功的实现了试管不需事前进行硅化与烘干处理。只需要将本促凝剂喷入试管内就可以了，不需进行烘干处理。使用效果与烘干处理的无差别。,现在，对于促凝剂促凝效果的评价都是以健康人为标准的。对于健康人来讲由于不存在凝血因子的缺乏，仅仅是为了加快凝血时间而促进血液的提前凝固。最重要的是对于缺乏凝血因子的患者要加快凝血的时间需要额外的补充所缺乏的凝血因子。因此，研发一种高效、快速的促凝剂显得十分重要。为了解决这个问题，我经过多年科研，成功的解决了这个问题。,我研制的促凝剂的原理如下：各厂家的配方虽然五花八门，所提供的凝血时间参数都是以正常人的数据为根据。然而，实际在医院中有血液系统问题与血栓疾病治疗、肝素化治疗、透析患者的治疗等病人还是很多的。在研制促凝剂时没有充分考虑到异常情况采血不利的因素的补偿，所以仍有部分病人在采血后凝血情况仍然不理想。拖了大多数人的后腿，延误了上机操作的时间。,由于凝血过程是通过多种凝血因子所参与的过程，所以研制促凝剂的配方必须综合考虑这些因子的补充。在配方中平衡各种因子的百分比，通过协调作用来弥补某些患者的不足，加速凝血过程。我研制的配方综合考虑了凝血不良的因素，在配方中重点考虑了异常情况采血的代偿。,本产品的原理如下：配方主要成分之一PHA 凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。常用的为植物凝集素（Phytoagglutin，PHA），通常以其被提取的植物命名如刀豆素A（Conconvalina，ConA等，凝集素是它们的总称。植物血凝素是一种具有胶凝性特点的蛋白质，它与血液中的抗原会发生化学反应引起红血球的聚集。在组分中PHA起着至关重要的作用。 本促凝剂已经申报了发明专利。,保证了产品的稳定性和持久性，达到了采血管工艺所需要的技术指标。,主要技术参数： 1、血液离体后5-8分钟凝集，健康人15-20分钟上机离心。离心时间5分钟，离心机转速为3500转/分。 2、无纤维蛋白：血清内无肉眼可见明显的纤维蛋白残留。 3、100%离心成功率。 4、温度在2-38血凝效果一样。 5、储存：放置4以下避光保存。 6、外观：混匀后呈白色均匀的混悬液，静置后下层为白色，上层为淡黄色半透明。,7、气味：闻起来有豆子的特殊气味。 8、加入真空管量：3-5毫升采血量加20-30微升。 8-10毫升采血量加25-30微升 12-16毫升采血量加35微升 9、包装量： 塑料试剂瓶包装，1000ml/瓶。,优点： 1、血清清晰度高。血块收缩紧密，倒置过来血块呈果冻状形成一个整体。 2、管壁清洁程度好，管壁上和胶塞上无血球等物质附着。 3、与血清分离胶不发生反应，血清分离胶离心后呈原色或仅有少量细微血点，外观清洁程度好。 4、采血后放置15分钟后离心。,5、对检验结果无干扰或影响。 6、无须烘干，不含有无水乙醇或乙醚。 7、促凝剂不用烘干，减少了加工环节，节约了时间与加工成本，使离心后的试管外观美观清洁。 8、试管采用普通PET试管，不须事先做硅化处理，促凝剂内已包含脱壁剂。玻璃试管必须做硅化处理。,使用前应将本品颠倒混匀多次，直至底部看不见沉淀为止。把本品倒入喷雾机的加液瓶内喷入硅化或未硅化过的试管内壁。不需烘干处理，然后抽真空压塞。,注意事项： 在喷促凝剂之前一定叮嘱工人用生理盐水充分清洗掉残留在喷头与管路里面的物质。尤其是喷过抗凝剂以后如果未清洗，很可能会发生化学反应，造成促凝剂的失效。如果用去离子水清洗，残留水过多会引起渗透压的改变导致溶血。,抽血验证实验,1、试管制备：将塑料PET试管不用经过硅化处理，在喷雾剂上直接喷入20-30微升左右的促凝剂。不用烘干，然后抽真空、压塞。 2、分别准备对照管与待验证管各若干支。 3、准备好消毒与采血所需物品。 4、常规消毒，然后用采血针刺入静脉把血液抽入试管内。 5、从采第一支试管完毕开始计时计算凝血时间，以后的试管依次按照实际完毕时间计时。 6、采血5分钟后开始缓慢倾斜试管观察凝血情况，如果初凝出现立即计时计算凝血时间。 7、从5分钟后每隔2分钟观察一下凝血情况，完全凝固以把试管倒置或倾斜后血液完全不流动为标准。 8、从采血完毕后放置20分钟开始上机离心，3500转/分离心5分钟。,9、结果判断：以离心后血清清晰无纤维蛋白，无挂壁、无溶血的血清为合格品。 10、统计：计算对照管和实验管的离心成功率与失败率，求出百分比。 11、温度：以室温15-35为测试温度。,促凝剂的质量控制,关于血液促凝剂的凝血效果检测问题，现在各公司均采用抽血试验的方法。此方法应尽量避免采用，因为各公司对于经常采用从员工中动员献血的方法，员工都对献血十分反感，另外，由于个体差异问题以及各批次与存放时间的不统一，都会给抽血实验造成差异，从而无法真实判断优劣。目前全国真空采血器企业尚无公认的统一的实验室检测技术方法。本促凝剂解决了这个难题，采用96孔国际标准血凝板检测与显微镜镜检相结合的方法， 其它促凝剂由于与本促凝剂配方原理不同，所以不能用本方法检测或检测不出来。,血凝试验 及 实验操作与结果判断,材料与试剂,1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，定量移液器，滴头，微型振荡器。 2. 0.9%生理盐水。 3. 待测液体未稀释的促凝剂。,实验内容及操作方法,（一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加0,2mL生理盐水。 2. 于左侧第1孔加0,2mL促凝剂，混合均匀后，吸0,2mL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃0,2mL；第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入2%人0型血红细胞悬液0.2 mL，在振荡器上振荡，室温下静置2小时后观察结果。,结果判定,从静置2小时后待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈红色点状。 以100% 凝集的最大稀释度为该血凝效价，如血凝价为1:256.位于第8孔。,2 % 红细胞制备方法,先用真空采血器（含3.8% 枸橼酸钠），采血至需要血量，加灭菌生理盐水为抗凝血的5倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成2 %人0型红细胞悬液。,血凝试验 (hemagglutinin test, HA),原理 血凝素PHA与人0型红细胞表面糖蛋白受体发生结合而发生凝集 检测血凝素的存在，滴定血凝效价，大致估计血凝效果。,结果观察 以发生50%凝集者(+)为该血凝效价，其稀释度即为一个血凝单位。,显微镜镜检法,1、取空白PET塑料试管一支，加入0.9%生理盐水5毫升。 2、向上述试管内加入促凝剂原液25微升，然后盖上试管塞，颠倒混匀5次。 3、取载玻片一枚，用蜡笔在中间划一道直线。 4、用加液枪吸取稀释后的20微升，分别加入玻片的两侧。以左侧端为检测区，以右侧端为对照区。然后在两端加入2%人O型血生理盐水混悬液各20微升。 5、把玻片旋转混匀一分钟，出现肉眼可见的凝集。 6、10分钟后将载玻片放在普通显微镜下，用低倍镜观察凝血情况。 7、结果判断：合格-血球凝集成小团块状，少量的游离红血球。 完全不凝集-血球呈均匀的颗粒状，无凝集现象。,出厂后的成品质量检验方法,1、批量抽检