组化3第三章酶组化.ppt

第三章 酶组织化学方法 第一节概述,酶是生物体内具有催化作用的特异性蛋白质，细胞内新陈代谢的合成和分解的生物化学反应都有酶的参与，因此，又称其为生物催化剂。 组织化学中的酶反应是指在一定的条件下，使组织细胞内的酶通过作用于酶的底物，使后者被分解形成某种初级反应产物，这种产物被捕捉剂所捕获而沉淀于原位上，然后将这种沉淀物变成具有可见性的最终产物，从而间接证明酶的定位。,酶酶的底物 最初的反应物另外物质 （金属盐） 不溶于水的显色产物,酶的分类： 1.氧化还原酶：是催化氧化还原反应的酶。 2.转移酶:是催化功能基团转移的酶。 3.水解酶:是催化水解反应的酶。 4.裂解酶:是催化分裂或合成化合物的酶。 5.异构酶:是催化同分异构体相互转化的酶。 6.合成酶:是催化将两种物质合成一各物质,并必 须与ATP分解相偶联的酶。,酶组织化学反应中注意事项,在制备标本及组化实验中必须做到既要最大限度地保存酶的活性，又要保存好组织细胞的形态结构，以保证酶在组织细胞中准确定位。 酶反应的温度、时间、PH必须控制好。 试剂的浓度配制必须准确。 所用器皿必须清洁，以防污染及出现假阳性。 必须做阳性或阴性对照试验。,第二节 若干酶组织化学反应程序,一、 碱性磷酸酶 （一）名称： 常用名：碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP） 水解酶，在碱性环境下催化水解磷酸脂生成磷酸和醇。在运输较为活跃的细胞膜上广泛分布，如毛细血管内皮细胞、肝内毛细胆管膜、肾近曲小管的刷状缘、肠上皮的纹状缘和神经细胞的突触膜等。,(二) 反应原理：,ALP在有激活剂（Mg 2 +）存在和PH9.4时，将其磷酸盐底物（如一甘油磷酸钠、一苯酚磷酸钠）分解产生甘油钠和磷酸离子，后者被孵育液中的氯化钙所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，但为非金属盐，需要加入硝酸钴，从而生成无色磷酸钴沉淀，再通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴。,（三） 光镜显示法 Gomori 改良钙钴法 1）溶液的配制： 孵育液： 3甘油磷酸钠 10ml 2巴比妥钠 10ml 2氯化钙（2.7%CaCl22H2O）20ml 5%硫酸镁(MgSO47H2O) 1ml 蒸馏水 5ml 调此液pH至9.4,可冰箱保存。 2硝酸钴（Co(NO3) 2） 0.5%硫化铵(NH4)2S)(新配),2)染色步骤: 石蜡切片脱蜡入水,或冰冻切片或 经10%福尔马林固定 15min; 入孵育液,37 30-40min (肾组织 10min, 肝组织60min); 流水冲洗5min ;, 2%（Co(NO3) 2)5 min; 蒸馏水洗; 1%(NH4)2S 1 min; 蒸馏水洗; 甘油明胶封片; 3）对照:孵育液中去除-甘油磷酸钠 。 4）染色结果： ALP活性的最终反应产物为棕黑色硫化钴沉淀。,5）说明： 钙钴法在一般实验室仍是常用的方法，但因其化学反应多次转换，容易造成定位不准确；石蜡切片虽然也能显示ALP活性，但经石蜡包埋处理（包括酒精、二甲苯、高温等），酶活性丧失大部分。,二、酸性磷酸酶 （一）名称： 常用名：酸性磷酸酶（acid phosphaatase, ACP） 主要位于细胞内的溶酶体内，是溶酶体 的标志酶。此外，尚有非溶酶体性ACP。 ACP在细胞退变过程中活性最强，在核酸和蛋白质代谢活动增强时，也见ACP活性增强。ACP也参与脂肪代谢。在神经传导冲动时，ACP参与Ca 2 +依赖的神经递质释放过程。总之，在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中ACP均具有一定的生物学意义。,（二）反应原理,显示酸性磷酸酶，先将切片放入含有酶底物（ -甘油磷酸钠 ）的溶液（PH5.0）中孵育，底物经酶水解，释放磷酸，用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅，沉淀于酶存在的部位，再用硫化铵处理，磷酸铅被置换形成粗颗粒状的黑色硫化铅沉淀物，便可用光镜看到。,（三）光镜显示ACP有铅法和偶氮偶联法： 1、 铅法： 1）孵育液的配制： 0.05mol/L醋酸盐缓冲液,pH5.0 10ml 蔗糖 0.8 g 硝酸铅 Pb(NO3)2 10mg 3%(约0.1mol/ L)-甘油磷酸钠 1 ml 按上述顺序加入,待硝酸铅完全溶解后再逐滴 加入底物,边加边搅至溶液完全透明。,2) 染色步骤： 石蜡切片脱蜡到水；冰冻切片或冰冻切 片冷福尔马林钙固定10 min后水洗； 入孵育液24 h（肝组织1 h左右）， 37； 双蒸馏水洗； 入1硫化铵（新配）溶液内12 min 流水洗。,1 3）对照： 在孵育液内加入0.01 mol/L氟化钠 (NaF)抑制剂后,ACP 反应呈阴性。 M 4）染色结果： ACP呈棕黑色硫化铅颗粒。 5）说明： ACP是可溶性酶，以冷固定后结果 较满 意.石蜡切片制作过程易使酶 失活。,三、核苷酸酶 （一）名称 常用名： 核苷酸酶（Nucleotidase）,核苷酸酶是一种特异性的磷酸单酯酶，它能水解核糖核苷和去氧核糖核苷在5位置的磷酸酯，如一磷酸腺苷（），一磷酸肌苷（），尿苷磷酸（UMP）,胞苷磷酸（）等，水解产生核苷和磷酸，但不能分解甘油磷酸，葡萄糖磷酸。核苷酸酶是一种最适p值相当广泛的酶。,（二）反应原理,底物经酶水解，用金属离子捕捉生成的磷酸离子而形成沉淀。即：腺苷磷酸水 腺苷磷酸。,（三）光镜显示方法 铅法（Wachs和Meisel 1956） （1） 取材：新鲜组织冰冻切片 （2） 孵育液的配制： 腺苷磷酸钠 4mg 0.2M Tris-苹果酸缓冲液 （Tris-maleate buffer）p7.4 4ml 0.1M MgSO4(2.5%） 1ml 2%硝酸铅 0.6ml 蒸馏水 0.4ml,（1）方法与步骤： 新鲜组织冰冻切片,或冷10%福尔马林 固定冰冻切片; 蒸馏水水洗; 入孵育液,恒温37,孵育2060分钟; 自来水洗; 入1%硫化铵1分钟; 蒸馏水冲洗; 甘油明胶封固。,(4)结果与评价: 棕黑色硫化铅沉淀为酶活性所在部位。 (5)对照: 可除去底物,或以甘油磷酸钠代替底 物,或加入碱性磷酸酶抑制剂溴化四唑草 酸盐可防止杂入的碱性磷酸酶起作用。,四、 葡萄糖6磷酸酶 (一)名称 常用名: 葡萄糖6磷酸酶（Glucose-6- phosphatase Phosphohydro- lase）,葡萄糖6磷酸酶是一种催化多种磷酸化合物水解的磷酸酶。例如它可以最快的速度催化葡萄糖6磷酸水解,也可以水解阿洛糖-6-磷酸、1,5-山梨醇聚糖-6-磷酸、甘露糖-6-磷酸、半乳糖-6-磷酸、核酸5磷酸及2-甘油磷酸,同时此酶还可水解焦磷酸、核苷三磷酸,果糖-6-磷酸、氨甲酰基-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸、磷酰胺盐和某些其它焦磷酸化合物。,（二）光镜显示方法 铅法（Wachstei和Meisel 1956） （1）原理：葡萄糖6磷酸被释放出磷酸后，为硝酸铅所捕获，最终反应产物为颗粒状的硫化铅沉淀。 （2）孵育液的配制： 0.125%葡萄糖6磷酸钠 4ml 0.2M Tris-苹果酸（Tris-Moleate） 缓冲液p6 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 蒸馏水 1.4ml 新鲜配制,充分混合后使用。,（1）方法与步骤： 新鲜组织,冰冻切片, 3%冷福尔马林固定5分钟; 水洗； 入孵育液,恒温37,孵育520分钟; 水洗； 入1%硫化胺1分钟; 水洗； 3中性福尔马林液后固定10分钟； 甘油明胶封固。,(4)结果与评价: 棕色硫化铅颗粒为活性所在部位。 (5)对照: 除去底物；以甘油磷酸钠代替葡 萄糖6钠盐 ；以0.01M氟化钠作抑 制剂。,五、三磷酸腺苷酶 (一)名称 常用名: 三磷酸腺苷酶（Adenosine triphosphatase， ATPase）,(二)反应原理 ATP酶是分解ATP产生ADP和磷酸的酶。ATPase水解磷酸之间的高能键，释放大量的能量，而不是水解磷酸与碳之间的键。释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，而通过形成硫化铅沉淀显色。最适p7.2。,根据ATP酶对激活剂、抑制剂的不同反应，以及超微定位观察，生物体内主要有三种三磷酸腺苷酶（ATPase）。 1、膜ATP酶：又分为Na+、K+激活 ATPase 和Mg2+激活ATPase； 2、肌球蛋白ATP酶：又称Ca2+激活 ATPase，因为它可被Ca2+激活； 3、线粒体ATP酶：由Mg2+激活的ATPase,（三）光镜显示方法 1、Mg2+激活的三磷酸腺苷酶铅法 （1）原理：ATP酶分解ATP释放出来的磷酸离子被铅离子捕获，通过形成硫化铅沉淀显色。最适p值为7.2。,（2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷钠盐 5mg 0.2M Tris-盐酸（Tris-HCl buffer） 4ml 2%Pb(N03)2 0.6ml 0.1M MgSO4 1ml 蒸馏水 4.4ml 配制时Pb(N03)2 要逐滴加入，并随时搅拌，使充分混合至无色或淡乳白色。,（1）方法与步骤： 新鲜组织,冰切片； 入孵育液，恒温37孵育2040分钟 蒸馏水洗； 入1%硫化胺1分钟; 流水洗； 甘油明胶封固。,(4)结果: 酶活性处呈棕黑色硫化铅沉淀。 (5)对照: 除去底物，则反应为阴性；以甘油磷酸钠代替底物，显示染色反应为碱性磷酸酶的定位。,2、Ca2+激活的三磷酸腺苷酸 钙-钴法（肌球蛋白型ATPase Padykula和Herman 1995） （1）原理：此法类似碱性磷酸酶的钙-钴法，但底物改用三磷酸腺苷钠盐，最适p值为9.0，对Mg2+型ATPase起抑制作用。 （2）孵育液的配制： 三磷酸腺苷钠盐 60mg 0.1M巴比妥钠 4ml 蒸馏水 2ml 0.18M CaCl2 2ml 2,4二硝基苯酚 30mg,（1）方法与步骤： 新鲜组织,冰冻切片； 入孵育液，恒温37孵育2040分钟 蒸馏水洗； 1CaCl2溶液换洗三次，每次2分钟 蒸馏水洗； 入CoCl2液5分钟; 流水洗； 入硫化胺液1分钟； 流水洗； 甘油明胶封固。,(4)结果与评价: 硫化钴黑色沉淀为酶活性所在部位。 (5)对照: 同铅法，可除去底物或用甘油磷酸钠作底物。,六、非特异性酯酶 （一）名称 常用名： 非特异性酯酶Nonspecific esterase） (二) 反应原理 随各种方法的不同，其原理不相同。,（三）、光镜显示方法 1、偶氮色素法（偶联偶氮色素法） 由于使用不同的重氮盐，具体方法也不相同，现分述如下： (1) 萘酚AS乙酸盐（Naphthol AS acetate）法 1）孵育液的配制： 1萘酚AS乙酸盐（丙酮溶液） 0.1ml 0.05磷酸缓冲液（pH 7.0） 10ml 坚牢蓝B盐 30mg （搅拌过滤使用）,2）方法与步骤： 新鲜组织恒冷箱切片，适当固定； 入孵育液，室温或37恒温孵育2030分钟 流水轻冲洗2分钟； 2甲基绿复染细胞核； 流水冲洗35分钟； 甘油明胶封固。 3）结果与评价： 酶活性部位呈黑色，胞核为绿色。活性部位的染色根据重氮盐的不同而不同，坚牢红TR为紫红色，坚牢蓝RR为青铜色。,七、脂酶 （一）、名称 常用名：脂（肪）酶（Lipase） (二)、反应原理 脂酶又名甘油酯水解酶，它能催化长链脂肪酸甘油（或其它醇）酯水解，Ca2+、Sr2+、Mg2+、半胱氨酸、巯基乙酸和牛磺胆酸盐（taurocholate）均能激活脂酶。,（三）、光镜显示方法 1、硫化铅法 （1）原理：以吐温为底物，在脂酶的作用下，分离出来的脂肪酸可与钙形成钙皂沉淀，进一步以铅置换钙，最后再经硫化铵生成棕黑色硫化铅沉淀。 （2）孵育液的配制： 5吐温60（或80）水溶液 2ml 0.2M Tris缓冲液（pH7.27.4） 5ml 10%氯化钙 2ml 蒸馏水 40ml,（3）方法与步骤： 将冰冻切片或福尔马林固定的冰冻切片 水洗 入孵育液，恒温37,孵育23小时； 1%CaCl2 液内浸洗; 1Pb(NO3)2浸15分钟; 流水冲洗5分钟； 0.50.1%硫化铵液内1分钟； 水洗； 甘油明胶封固。,(4)结果与评价： 磷酸黑色硫化铅沉淀为酯酶活性所在部位。 （5）对照： 去除底物吐温60（或80），反应即为阴性。,八、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶 (一) 名称 常用名:乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase), 胆碱酯酶(cholinesl-eraes) (二)反应原理 广义的胆碱酯酶可分为乙酰胆碱酯酶(AChE)和狭义的胆碱酯酶(ChE)两大类。二者的化学性质不同。用酯来检测底物特异性时，AchE能最快地促进乙酰胆碱分解，也能分解乙酰基甲基胆碱，但不能分解苯甲酰（基）胆碱，同时，此酶能被高浓度的乙酰胆碱所抑制，但是ChE则不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被ChE所分解。,（一）光镜显示方法 1、亚铁氰化铜法 （1）原理：利用乙酰胆碱酯酶能将乙（或丁）酰硫胆碱盐水解产生硫胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜（Copper ferrocy anide）而呈色沉淀。证明酶活性的存在。若用四异丙基焦磷酰胺 (Tetra isopropyl pyrophospho ramide),抑制非特异性胆碱酯酶，就可以单独显示胆碱酯酶（AChE）。,（2）孵育液的配制： 乙酰硫胆碱碘盐(acetyl thiocholine iodide) 5mg 0.1M醋酸缓冲液pH5.5(acetate buffer) 6.5ml 0.1M （2.94%）柠檬酸钠 0.5ml 30mM(0.75)CuSO4 1.0ml 蒸馏水 1ml 5mM(0.164%)铁氰化钾(potassium ferricyanide) 1ml 乙酰硫胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后， 依次入其他溶液，临