(论文)LC-MSMS法测定牛肉中玉米赤霉醇的残留

LC-MS/MS法测定牛肉中玉米赤霉醇的残留张晓东 朱叶青 朱惠珍（内蒙古自治区食品药品检验所 呼和浩特 010020）摘要：目的：建立动物源性食品牛肉中玉米赤霉醇的残留分析方法。方法：采用叔丁基甲醚溶剂提取牛肉中玉米赤霉醇的残留，以乙腈-水（70：30）为流动相，流速0.8ml，进样量50l，经高效液相色谱分离，以多反应监测（MRM）测定。结果：本方法在0.5-6.25ng/ml内线性良好（r=0.9998）；检出限0.2g/kg；方法回收率为80.45%，RSD为3.21%。结论：本方法稳定、可靠、准确，可用于动物源性食品牛肉中玉米赤霉醇的残留分析方法。关键词：液相色谱-串联质谱 牛肉 玉米赤霉醇 食品安全Vestigital of Zeranol in Beef by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry zhang xiaodong zhu yeqing zhu huizhen（Inner Mongolian Institute for the Control of Drug and Food， Hohhot，010020）Abstract：Aim：To establish a method for determination the zeranol in beef .Methods：Methyl t-Butyl Ether was used for extract zeranol in beef. With mobile phase consisting of Acetonitrile-water（70：30）and eluted at flow rate of 0.8ml.min-1 at 25 .inject volume 50l To Separate by HPLC, to analysis with MRM.Results The line ranges for zeranol were within 0.56.25ng/ml .the limit of detection was 0.2g/kg.the average recorvery was80.45%（RSD3.21%）.Conclusion：This method could be used for the determineation of zeranol in beef，and stable、reliable and accurate.Keywords Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，beef，Zeranol，the safe of foods玉米赤霉醇（zeranol，ZER），属于雷索酸内酯类非甾体同化激素。ZER作为牛羊促生长剂，以耳根埋植的形式应用，促进蛋白质的合成，能提高胴体瘦肉率及饲料转化率。但是，玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，在动物尿液中的残留会引起人体性机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，还可能致癌。ZER排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染及环境污染。1998年欧盟禁止将玉米赤霉醇等激素类药物应用于畜禽养殖，我国农业部第235号公告明确规定玉米赤霉醇禁用于所有食品动物，所有可食动物不得检出。我国尚未统一制订动物性食品中玉米赤霉醇残留检测的行业标准。由于玉米赤霉醇作为牛羊增重剂效果好，经济回报高，仍有违法使用的现象，尤其是我区作为一个乳业比较发达的地区，在对其残留控制上更应引起人们的重视。研究建立动物源性食品牛肉中ZER的检验方法，给政府、企业及相关部门提供检测技术，对牛肉中的ZER残留进行检测，对保障我国食品安全具有重要意义1。1 实验部分1.1实验仪器与材料API3200LC-MS/MS串联质谱仪（美国AB公司），配LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）和大气压化学电离源。SIGMA 2-16K型冷冻离心机，IKA T18 basic型均质机，VS-100 VORTEX SHAKER 型振荡器，TTL-DL型氮吹仪，24-Port SPE Vacuum Manifold System固相萃取装置，玉米赤霉醇标准品；叔丁基甲醚（分析纯），乙腈（色谱纯），正己烷（分析纯），二氯甲烷（分析纯），葡糖苷酸酶1.2 分析条件液相色谱条件：色谱柱：ZORBAX C8 5m 3150mm；流动相：乙腈-水（70：30）；流速：0.8ml；柱温：室温；进样量：50l质谱条件：离子源：APCI，扫描方式：负离子扫描：Curtain Gas：20psi；Collision Gas：6psi；Ion Source Gas1：35 psi；Ion Source Gas2:45 psi；离子源温度350：监测离子及碰撞能量：321.1/277.2（-8eV）；321.1/303.2（-6eV）；321.2/259.3（-6eV）1.3 玉米赤霉醇标准储备液：取玉米赤霉醇对照品10mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度（1.0mg/ml）。再逐级用流动相稀释至所需浓度。1.4 样品的制备：提取 取待测样品5.00g，置50ml离心管中，加入20ml叔丁基甲醚，涡旋5min，4600r/min离心5min，将上清液全部转移至另一50ml具塞试管中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min，加入15ml乙酸盐缓冲液（pH5.2）后，涡旋5min，4600r/min离心5min，将上清液全部转移至另一25ml具塞试管中，并在氮气浓缩仪上于40吹去残余叔丁基甲醚后，加入80l葡糖苷酸酶混匀，于52烘箱中放置过夜，在此缓冲液中加入氢氧化钠溶液（3mol/L），将溶液pH值调至7，加入10ml叔丁基甲基醚，充分混合，4000r/min离心2min，移取叔丁基甲基醚层与前述的叔丁基甲醚提取液混合，在氮气浓缩仪上于40水浴中吹干，加入1ml溶解液正己烷+二氯甲烷（60+40），涡旋30s，待净化。净化 把样液转入硅胶固相萃取柱（使用前用6ml正己烷预洗硅胶柱），在样品试管中加入3ml淋洗液乙酸乙酯+正己烷（6+94），混合后过柱，用3ml淋洗液淋洗，加入2ml空气吹过硅胶柱，用6ml洗脱液乙酸乙酯+正己烷（60+40）洗脱，加入2ml空气吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪上于40水浴吹干，加入1ml流动相，涡旋30s溶解。溶液经滤膜过滤后，供液相色谱串联质谱测定2。2 结果与讨论：2.1 LC-MS/MS条件的选择选择不同的液相色谱柱及色谱质谱条件，最后确定出1.2的LC-MS/MS质谱条件检测玉米赤霉醇。玉米赤霉醇标准品的多反应监测（MRM）图及定向性离子的质谱图见图1、图2。应用1.2中的色谱-质谱条件进行分析。通过保留时间以及各离子之间的丰度比值可以定性确定玉米赤霉醇是否存在，排除假阳性的产生3。2.2 标准曲线和检出限玉米赤霉醇在0.5 -6.25g/L范围内线性关系良好，取0.5g/L、1.25g/L、2.5g/L、5.0g/L、6.25g/L的溶液，用1.2的LC-MS/MS条件进行测定，得到子离子321.1/277.2的峰面积和浓度。以二级子离子321.1/277.2浓度（X，ng/ml）对峰面积（Y）进行线性分析，线性方程为Y=410x+74.5(r=0.9998)。方法的最低检出限为0.2g/kg（S/N3）。2.3 方法的准确度与精密度取经测定不含有玉米赤霉醇的样品5.00g9份，分别加入20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml的标准工作液100l，按1.4方法操作，测得9份的回收率。实验结果见表1 表1牛肉中玉米赤霉醇的添加回收率序号加入量(ng)测得量(ng)回收率（）平均回收率（%）RSD（）12.0121.70984.94 22.0121.67583.25 32.0121.59679.32 44.0243.18979.25 54.0243.20179.55 80.453.2164.0243.06576.17 76.0364.82179.87 86.0364.95182.02 96.0364.81179.71 2.4 实际样品的测定应用本方法测定了五个地区的牛肉各1批（样品称样量为5.00g），测得的ZER的残留量见表2 表2牛肉中ZER残留量样品 1 2 3 4 5 测定值（ng/g） 0.56 ：未检出（阴性样品图见图3）2.5 本方法适用于牛、猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇的残留量的测定。图1 标准品MRM图图2 标准